2021/03/10
RNA-seq
一、真核物种普通转录组测序
二、链特异性转录组测序
1、链特异性
DNA双链反向互补，参考基因组是正链，与之反向互补的是反链。
正义链 sense strand：携带有编码蛋白质氨基酸信息的链 编码链
反义链 antisense strand：作为转录模板的链，与RNA反向互补 模板链
2、方法
（1）差异接头法 differential adaptor methods
（2）差异标记法 differential marking methods
-
亚硫酸氢盐处理
6 - 在第二条cDNA链合成过程中，降解未标记的链
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链特异性转录组测序
3、链特异性RNA测序方法的全面比较分析
Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods
（1）样本：酿酒酵母 GSE21739
（2）建库方案
sample
三、LncRNA测序
1、lncRNA分类
根据染色体上与编码基因的相对位置分类：
- 反义型 antisense lncRNAs ：是指由基因（通常是蛋白编码基因）的反义链转录，并与该基因的mRNA存在序列重叠的RNA分子。
- 内含子型 intronic lncRNAs
- 反向型 divergent lncRNAs
- 基因间型 intergenic lncRNAs
- 启动子上游型 promoter upstream lncRNAs
- 转录起始位点型 transcription start site-associated lncRNAs
2、lncRNA是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，不编码蛋白，以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）参与蛋白编码基因调控。
- 表观遗传调控
招募染色质重构（与转录相关的染色质结构改变称为染色质改造或染色质重构）和修饰复合体到特定位点，改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态（组蛋白的修饰：甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化，DNA的修饰：甲基化、磷酸化），进而控制相关基因的表达。
例：H3K4me3 - 转录调控
I：作为配基与一些转录因子结合，形成复合体，控制基因转录活性。
II：本身就是转录因子 - 转录后调控
I：可变剪切
II：RNA编辑
III：蛋白翻译及转运过程 - 调控miRNA
控制miRNA表达来影响其靶基因的表达量
例：在一些肿瘤细胞和特定组织中，一些lncRNA会携带有某些miRNA的种子序列（种子序列是与靶基因结合的关键序列，一般定义为miRNA全长2-8nt处，但也不一定，有时可能会发生变化。），结合miRNA，阻止miRNA与靶mRNA结合。
例：antisense lncRNA影响正义链基因表达的作用机制：
I：antisense lncRNA的转录过程抑制正义链基因的转录，调控了基因的表达
II：结合DNA或组蛋白修饰酶，调控所在基因座位的表观遗传学，从而影响正义链基因的表达
III：与正义链mRNA结合，影响mRNA的可变剪接
3、测序
在建库环节，利用试剂盒去除总RNA中的核糖体RNA（rRNA），将剩余的RNA拿去测序，就是LncRNA测序。不仅仅可以测得LncRNA，同时也能测到mRNA，甚至还能获得部分环状RNA的信息。
4、一般分析流程
- LncRNA差异表达研究：利用Cuffdiff软件计算lncRNA转录本的表达量FPKM
- lncRNAs cis（顺式）调控研究：查找蛋白编码基因上下游10-kb的区域的lncRNA，对共表达基因进行GO和KEGG富集分析，研究它们相关生物学功能。
- lncRNAs trans（反式）调控研究：同样对共表达基因进行GO和KEGG富集分析，研究它们相关生物学功能和通路。
- qPCR验证：随机挑选6个差异表达lncRNAs进行qPCR验证
qPCR结果显示与RNA-Seq的一致性。说明高通量测序和生信分析lncRNA的可靠性非常高。 - lncRNA-mRNA共表达网络分析:利用差异lncRNA和差异mRNA构建共表达网络
四、circRNA测序
1、环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。
2、通过去除total RNA中的rRNA和线性RNA分子，可以特异地富集环状RNA分子后测序，更有针对性地分析受检样本中特定的环状RNA谱、环状RNA剪接模式、组间差异和分子功能等。
五、小RNA测序
1、Small RNA（miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等）
2、测序和基本数据处理
- 对总RNA(或small RNA)样品进行检测，检测合格后进行small RNA样品制备，经过下A克隆检测合格之后上机测序。
- 基本数据处理包括：图象识别、碱基识别、过滤接头序列和污染序列、去除低质量序列。
3、分析内容
- small RNA长度的分布统计：对获得序列的分子长度和数量进行统计分析，长度分布统计可用于验证实验的可靠性。
- microRNA碱基偏好性鉴定：统计microRNA碱基使用偏好是检验数据质量的依据。
- 与数据库进行比对注释small RNA：将得到的序列分别与miRBase数据库、mRNA/EST数据库、rRNAetc等数据库进行序列比对，鉴定出已知的microRNA。
- 将small RNA定位到基因组，探索其在全基因组的分布特征;
- 两个样本的公共序列和特有序列分析;
- 通过与Rfam 9.1数据库以及GenBank数据库比对，鉴定rRNA、tRNA、snRNA等降解片段;
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鉴定与重复序列相关的small RNA：部分small RNA来源于高重复区域或转座子区，它们会与不同的Argonaute蛋白结合并且参与一些重要的生物学过程，例如DNA甲基化和转座子的调控。这些small RNA被称作重复序列相关的small RNA (repeat-associated small RNAs)。根据结合的Argonaute蛋白不同，它们可以被细分为不同的类型 。
Argonaute蛋白在进化过程中演变出了各种亚科蛋白。这些亚科蛋白可以识别各种不同类型的小RNA分子，从而在各种小RNA沉默途径中发挥作用。 - 鉴定mRNA降解片段;
- small RNA分类注释;
- 预测新的microRNA;
- 单个样本的microRNA表达模式分析
- 两个样本的microRNA差异表达分析
- microRNA的表达模式聚类分析
- MicroRNA靶基因预测。
- 预测新的microRNA：MicroRNA前体的标志性发夹结构能够用来预测新的microRNA。将测序得到的序列比对到该物种的基因组后，截取附近区域的一段序列，通过折叠模型分析，如发现该序列位于茎环结构上，则初步判定该序列为一个候选的新microRNA
4、MicroRNA Analysis Using Next-Generation Sequencing
2018-01-01 DOI ：10.1007/978-1-4939-8624-8_8
