单细胞转录组，顾名思义，是测定单个细胞转录本的组学分析。通过10X单细胞测序可以获得单个细胞中的基因表达信息。相较于普通的bulk测序，单细胞测序可以得到清晰度更高的转录组信息。我们可以通过单细胞测序找到关注的细胞类型，并对不同的细胞类型进行进一步的分析，找到关注细胞亚群的基因和通路变化，预测细胞分化的轨迹、细胞间的通讯关系。10 X Genomics单细胞转录组测序平台利用微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势。该技术主要用于细胞分型和标记因子的鉴定，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，此外该技术还可以预测细胞分化与研究发育轨迹，在当下疾病、免疫、肿瘤领域以及组织、器官、发育研究中发挥越来越重要的作用。

10X 单细胞转录组测序介绍

10xGeromics 技术是一种单细胞RNA测序的方法，利用微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势。该技术可实现上千个细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的华基因表达谱和差异情况，实现细胞群体的划分，与细胞群体之间差异的表达基因的分析。 该技术主要用于细胞分型和标记因子的鉴定，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，此外该技术还可以预测细胞分化与研究发育轨迹，在当下疾病、免疫、肿瘤领域以及组织、器官、发育研究中发挥越来越重要的作用。

研究领域                                                       技术优势

细胞异质性研究                                      不需要微量扩增，降低假阳性率

免疫反应                                                   灵活获取量，可一次性对500-10000个细胞建库

定点编辑基因细胞水平研究                       提升效率

发育及分化                                                 7分钟之内即可完成单细胞体系制备，捕捉效率高新型细胞发觉达65%

构建细胞图道                                             成本低广泛研究应用领域，超短项目周期

细胞类型

生殖细胞、胚胎细胞神经细胞他疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、其它原代细胞

10xGenomics 单细胞转录组测序的原理

那么单细胞测序又是如何实现的呢？我们以单细胞RNA-seq作为例子，简单的来介绍一下该技术得以实现的原理：

一，将单细胞分离出来，单独构建测序文库，并进行 测序。这种思路通量极低而且成本极高，如前文所说烧掉很多钱就测数十个细胞，而往往这数十个细胞还不足以反应真实的科学问题。所以我们着重介绍第二种方案。

二，基于标签（barcode）的单细胞识别。它的核心思想是：在对每个细胞的mRNA测序前做逆转录时，为其加上独一无二的标签序列。这样即便是混合起来测序，我们也可以把携带相同标签序列（barcode）的RNA片段视为来自同一个细胞。通过这种策略，我们可以通过一次建库，测得上万个单细胞的信息（如下图所示）。

技术核心油滴包裹的凝胶珠(GEMs)

该系统有75万种 barcodedbeads， 每个bead上有40-80万探针。

首先介绍(Gelbead)，Gelbead 股珠和应珠上的段引物构成，Gelbead上连接的引物序列包含四个部分：IluminaTruSeqReadl测序引物、16nt 的条形码(Barcode)、12nt的UMI和30nt 的Poly (dT)反转录引物。

TruSeqReadl 测序引物，为为 段已知的短肤核有酸序列，用于后续的上机测序。

Barcode：有400 万种 Barcode, 一个微珠对应种 Barcode, 通过这400 万种Barcode，可以把凝胶微珠给区分开。

UMI是由随机碱基组成的一段序列，每个DNA分子都有自己的UMI序列，在混合测序时，用于区分不同的样本。能够区分哪些reads是来自于一个原始cDNA分子，区分基因片段是重复还是duplication及区分是真实的单核自酸多态性(SNP)位点还是PCR 产生的突变。、

Poly(dT)VN反转录引物，是含有30个T减基的同聚 DNA片段， 具有启动子的作用。用于捕获有polyA尾的转录本，其能够在扩增末端自动加上三个C，在反应buffer中的TSO酶前含有个三个G会与c五补，完成二链扩增。

10xGenomics 基于微滴的核酸条形码分配系统，该系统提供了数以百万计级的携带唯一DNA 条形码的微滴，通过微流控技术，有先将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴（GEMs）中。凝胶珠溶解，细胞裂解释放RNA，通过逆转录产生用于测序的带条形的和UMI信息的cDNA，液离油层破碎，cDNA扩增，制备CDNA 文库，然后对文库进行测序检测，即可获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

然而，在单细胞测序的过程中，细胞的空间位置由于实验造成了信息丢失，因此，我们可以通过10X Visium空间转录组得到细胞的空间位置信息。10X Visium空间转录组结合显微成像技术和RNA测序技术，能够从一片完整的冰冻组织切片中获取切片不同位置细胞中的转录组数据。不仅将组织学和基因表达分析相结合，分析空间区域上的基因表达情况。细胞和组织之间的关系对于理解发育和疾病病理学是至关重要的。10X Visium空间转录组测量完整组织切片的mRNA，并绘制基因活动发生的图谱，在确定不同组织群的同时保留空间环境，为细胞功能、表型和组织微环境中位置的关系提供了重要信息。

技术流程

1.制备好的细胞悬液、10X barcode凝胶磁珠和油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室(下图左)，经由微流体“双十字”交叉系统形成GEM(下图右)。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700-1200细胞/ul，因此产生的90-99% GEM不含有细胞，剩下的大部分GEM含有一个细胞；

2.单个GEM 依次形成后最后全部混合在一起，细胞裂解内容物释放出来，而凝胶珠溶解释放大量的引物序列。

3.释放的引物中包含30nt poly dT反转录引物，带有polyA的RNA被反转录为带有10XBarcode和UMI信息的CDNA一链，再以SMART方式完成二链合成；

4.油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后PCR扩增cDNA；

5.cDNA扩增完成后酶切片段化并磁珠筛选最适片段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，再以PCR方式构建含有P5和P7接头的cDNA文库；

6.最后构建的文库如下：