影响因子：14.3

研究概述：细胞衰老是一种稳定的细胞周期停止状态，限制了它们的增殖能力。这种机制作为一种保护措施，可防止基因组不稳定，从而减少 DNA 损伤的累积。然而，某些癌基因的异常表达或抑癌基因的丧失所引发的癌变压力，也会导致肿瘤细胞发生衰老。作为肿瘤微环境（TME）中的关键基质成分，癌相关成纤维细胞（CAFs）在其细胞起源、表型和功能特性等方面表现出显著的生物学多样性。大量文献表明，CAFs 在肿瘤发生的多个阶段通过多种分子通路发挥作用。证据表明，衰老的成纤维细胞可能促进多种癌症中肿瘤的发生和扩展。因此，CAFs 在癌症发生和免疫治疗中的精确功能和复杂机制仍需进一步阐明。在本研究中，作者首先在 40 个泛癌scRNA-seq数据集中（涵盖 17 种癌症、406 名患者及 881,332 个细胞）对 CAFs 的衰老状态进行了表征。随后，基于这些大规模的 scRNA-seq 数据集，建立了成纤维细胞衰老相关特征。通过 10 种机器学算法在 14 个泛癌的免疫检查点抑制剂（ICI） RNA 测序数据集中（包括 1,052 名患者）进一步验证预测免疫治疗反应方面的有效性。此外，通过对 17 个 CRISPR/Cas9 阵列的分析，作者发现 CDC6 是最有前景的靶点，并通过实验验证了其在胰腺癌（PC）中的效果。具体结果如下：

研究结果：

肿瘤微环境中细胞衰老图谱

在本研究中，作者提出，与成纤维细胞（CAFs）衰老相关的转录组改变可能是预测癌症患者生存结果和免疫检查点抑制剂（ICI）反应的强大生物标志物。为了验证这一假设，作者分析了 40 个泛癌scRNA-seq数据集（包含 881,332 个细胞）。作者发现 CAFs 在 40 种癌症类型中表现出最高的 GSVA 分数（即衰老分数），显著高于肿瘤微环境（TME）中其他细胞群体，包括恶性肿瘤细胞、B 细胞、NK/T 细胞和内皮细胞（图 A）。对三种特定癌症类型——乳腺癌、胆管癌和结直肠癌的亚组分析进一步表明，CAFs 的衰老分数比较（图 B–D）。

基于泛癌单细胞 RNA 测序分析建立成纤维细胞衰老相关特征（FSS）

鉴于衰老 CAFs 与抑制性TME之间的显著相关性，作者提出，FSS 可代表肿瘤中 CAFs 的衰老水平，并用于预测免疫检查点抑制剂（ICI）疗效。为此，作者利用了 40 个泛癌单scRNA-seq数据集来构建 FSS（图 A）。在这些泛癌 scRNA-seq 数据集中，作者通过 Spearman 相关性分析，评估了基因表达水平与成纤维细胞衰老分数之间的相关性。与衰老分数正相关（Spearman R > 0 且 FDR < 0.05）的基因被标记为 FSx，而在成纤维细胞中差异上调的基因被标记为 FSy。通过对 FSx 和 FSy 取交集，作者得到了每个数据集中与衰老正相关且在成纤维细胞中特异性上调的基因（FSn）。为了进一步探索 FSS 涉及的生物学事件，作者对 FSS 基因进行了GO和KEGG的通路富集分析（图 B-C）：这些通路主要富集于细胞周期、基因重塑、与癌症相关以及 ICI 相关的过程，这与之前关于衰老成纤维细胞粘附性增强特征的研究结果一致。为了进一步探讨 FSS 与 TME 的关系，作者基于 109 个 FSS 基因，利用 GSVA R 包计算了 TCGA 数据集中 30 种癌症类型每位患者的 FSS 分数。总体分析显示，HNSCC、BRCA 和 BLCA 等实体瘤具有较高的 FSS 分数，而 TGCT、PCPG 和 KIRP 表现出较低的分数。随后，作者使用 MCPcounter R 包评估了肿瘤中免疫细胞的丰度。结果显示，高 FSS 分数的肿瘤中，抗肿瘤免疫细胞（包括 CD8+ T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞）的浸润水平显著降低（图 D）。接着，作者分析了 FSS 分数与 HALLMARK 基因集合之间的相关性，以探讨高FSS 分数的肿瘤中是否富集了免疫抑制通路。结果发现，在 FSS 分数较高的患者中，TGF-β 信号通路、凋亡通路、Notch 信号通路及低氧通路等排名靠前的通路表现出显著上调（图 E）。此外，作者还对 FSS 与 TMB 之间的关系进行了分析。基于 TCGA 泛癌数据集中 FSS 分数和 TMB 的中位值，患者被分为八个亚组：高 FSS（HF）、低 FSS（LF）、高 TMB（HT）、低 TMB（LT）、高 FSS–高 TMB（HFHT）、高 FSS–低 TMB（HFLT）、低 FSS–高 TMB（LFHT）及低 FSS–低 TMB（LFLT）。高 FSS 表明较差的 ICI 反应，而高 TMB 则反映相反的趋势。在 HF 和 LT 亚组中，细胞毒性淋巴细胞的浸润水平较低（图 F-G）。此外，LFHT 亚组具有显著较高的细胞毒性淋巴细胞浸润，而 HFLT 亚组表现出最少的浸润（图H）。因此，FSS 较高且 TMB 较低的患者（HFLT）可能拥有缺乏细胞毒性淋巴细胞的 TME，而 LFHT 亚组患者则表现出较高的细胞毒性淋巴细胞浸润。然而，HFHT 和 LFLT 亚组的免疫特征较为复杂，因为 HFHT 和 LFLT 同时包含免疫缺陷（HF 或 LT）和免疫活性（LF 或 HT）因素。综上，免疫系统抗肿瘤能力的强弱排序为：LFHT > LFLT > HFHT > HFLT（图 H）。因此，FSS 较低的患者往往具有更强的抗肿瘤免疫能力，而 FSS 较高的患者则显示出较差的抗肿瘤免疫能力。

基于 FSS 预测 ICI 反应

为了评估 FSS 在预测 ICI 反应中的潜力，作者收集了 14 个包含完整测序数据和免疫治疗临床结果的 ICI 队列（图 A）。首先，作者整合了 6 个ICI数据集（n = 821）：RCC_Bruan_Cohort（n = 181）、UC_Mariathasan_Cohort（n = 348）、SKCM_Liu_Cohort（n = 121）、SKCM_Gide_Cohort（n = 73）、SKCM_Riaz_Cohort（n = 49）和 SKCM_PUCH_Cohort（n = 49）。接着，作者利用 10 种机器学习算法在训练集中进行模型构建，并在 5 次重复的 10 折交叉验证中进行验证，以优化模型性能。最终选择 GBM 作为最佳模型，其在验证集中实现了最高的AUC值 0.86（图B-C）。为了进一步验证 FSS 的预测能力，作者将 GBM 方法应用于测试集（n = 190）和内部队列（n = 41），分别获得了 0.79 和 0.77 的 AUC 值（图 D-E）。此外，患者根据模型预测的高风险（预测为非应答，NR）和低风险（预测为应答，R）分组，用于生存评估。Kaplan-Meier 生存曲线显示，在验证集、测试集和内部队列中，低风险组表现出显著更好的总体生存结果（图 F–H）。为了全面评估 FSS 在预测 ICI 反应中的价值，作者将其与现有的泛癌特征（包括 INFG_sig、Tcell_sig、Cytotoxic_sig、PDL1_sig、CAF_sig和 NLRP3_sig）的预测性能进行了比较。尽管这些特征在单一数据集中的表现良好，FSS 在与皮肤黑色素瘤、胶质母细胞瘤、尿路上皮癌、胃癌和非小细胞肺癌相关的队列中表现出色（图 I-J）。

基于 FSS 的生存预测

为了优化 FSS 在泛癌水平上的生存预测能力，作者采用了 SurvBenchmark 设计框架，基于 FSS 构建了生存预测模型。作者将 TCGA 数据中的泛癌患者分为两组：训练集（占 80%，n = 7865）和验证集（占 20%，n = 1950）。在训练集中开发了基于 FSS 的预后模型，并在验证集中计算了 AUC、时间依赖性 AUC 和 C_index 以评估模型性能（图A）。MTLR_DE 模型在验证集中表现最佳，被确定为最优模型。MTLR_DE 是一种基于排名的方法的多任务逻辑回归模型，用作特征选择算法。在该算法中，基于中位生存时间对良好和较差总体生存OS状态进行差异表达分析，从而筛选出特征基因，最终筛选出 10 个基因（CDC6、PITXQ、TGFBI、CHEK1、CEBPB、IFI16、CD82、PGR、PEBP1 和 RBL2）（图 B）。为了验证该模型，作者通过 MTLR 算法计算每位患者的个体风险评分，并在验证集中进一步验证模型的性能。结果表明，最终模型在验证集、测试集和内部数据集中均具有较高的 AUC 值（图 C），并且风险评分较高的患者在所有数据集中均表现出更差的 OS 率（图 D）。

通过 CRISPR/Cas9 筛选 FSS 潜在靶点

上文提及作者确定 ICI 应答的潜在靶点对于推动 FSS 的临床应用至关重要。为此，作者分析了来自 7 个 CRISPR/Cas9 研究的 17 个数据集，这些研究根据细胞系类型和治疗条件对敲除基因进行了分类，同时整合了 ICI 应答信息。作者对 22,505 个 CRISPR 基因进行 z-score 排序，将排序靠前的基因定义为免疫耐受基因。具体而言，排序靠前的基因在敲除后可能增强抗肿瘤免疫，而排序靠后的基因则可能削弱抗肿瘤免疫。随后，作者将 FSS 中的基因与其他已建立的免疫耐受特征排序靠前的基因比例进行比较。结果表明，在 FSS 中排名前 10% 的基因（n = 15）显著富集（p < 0.01）。这些基因在多个独立的 CRISPR/Cas9 数据集中得到了额外验证，并作为免疫治疗靶向的潜在候选基因（图 A）。

为了进一步探索 FSS 中的潜在靶点，作者分析了从 CRISPR/Cas9 数据集中筛选的 15 个基因以及 FSS 预后模型中包含的 10 个基因（图 B）。最终，CDC6 被确定为核心基因（图 B）。22 个泛癌队列中的 19 个（86%）中，CDC6 的 mRNA 水平在肿瘤组织中显著高于正常组织，并且 CDC6 表达升高与较差的 OS 相关（图 C）。来自 HPA数据集的免疫组分析也显示，CDC6 在肾脏、肝脏、胰腺和皮肤的肿瘤样本中具有更高的蛋白表达水平（图 D）。

在胰腺癌（PC）细胞中下调 CDC6 可增强免疫治疗的反应

为了阐明 CDC6 在抗肿瘤免疫中的作用，作者建立了一个包含 CD8+ T 细胞和 CD14+ 单核细胞衍生巨噬细胞与胰腺癌类器官共培养的系统（图 A）。在 CDC6 在胰腺癌类器官中被敲低后，作者确认 CDC6 的 mRNA 和蛋白表达均显著降低。值得注意的是，经典衰老标志物 p16 的表达也随之降低，这表明 CDC6 的沉默可能会削弱 TME 中成纤维细胞的衰老状态。形态学评估和 CTG 分析显示，CDC6 敲低的胰腺癌类器官的生长速度显著减慢（图B）。此外，免疫组化析显示，与对照组相比，CDC6 敲低的类器官中 PD-L1 和 Ki-67 的表达明显减少（图 C）。qRT-PCR 对共培养系统的分析显示，与 CDC6 敲低的类器官相互作用的细胞中，ICI 相关基因的表达显著上调。同时，观察到 M2 型巨噬细胞相关标志物表达降低，而 M1 型巨噬细胞标志物表达升高（图 D），这表明巨噬细胞由促肿瘤极化向抗肿瘤极化转变。流式细胞术进一步证实了这一发现，显示 CDC6 敲低的类器官显著增强了 CD8+ T 细胞的激活和增殖（图 E），同时与对照组相比，M1 型巨噬细胞的极化更为显著（图 F）。为了在体内验证这些观察结果，作者在 C57BL/6 小鼠中建立了 KPC 皮下异种移植模型，并腹腔注射抗 IgG 或抗 PD1 抗体。值得注意的是，与对照组相比，CDC6 缺失的肿瘤对抗 PD1 治疗的敏感性显著增强，表现为更显著的肿瘤缩小（图 G-H）。对肿瘤样本的 IHC 分析显示，CDC6 缺失的肿瘤中免疫细胞浸润增加，同时增殖指数降低（图 I）。

肿瘤细胞来源的 CDC6 通过 TGF-β1 分泌和氧化应激驱动成纤维细胞衰老

为了研究 CDC6 与成纤维细胞衰老之间的功能关系，作者建立了一个肿瘤细胞与成纤维细胞的共培养系统（图A）。结果显示，在胰腺癌细胞中过表达 CDC6 可显著诱导共培养的成纤维细胞衰老，表现为 SA-β-半乳糖苷酶活性增强（图 B）、p16+ 成纤维细胞比例增加（图 C），以及衰老相关分泌表型（SASP）因子的表达水平升高（图 D）。鉴于 TGF-β1 是细胞衰老的经典调控因子，作者进一步探讨了 TGF-β1 在 CDC6 介导的成纤维细胞衰老中的潜在作用。实验结果表明，CDC6 过表达的肿瘤细胞中 TGF-β1 的水平（包括细胞内和培养基中的浓度）显著升高（图 E），这一结果通过 ELISA 进一步验证（图 F）。共培养的成纤维细胞显示出 TGF-β-SMAD2/3 信号通路的激活，从而启动纤维化和衰老程序（图 G）。值得注意的是，使用 TGF-β 信号抑制剂 LY2109761 可完全阻断 CDC6 诱导的成纤维细胞衰老（图 G），表明 TGF-β1 是这一过程中的关键介质。由于 CDC6 被认为与压力诱导的衰老有关，作者接下来研究了氧化应激在该过程中的作用。已知 N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种强效抗氧化剂，可抑制氧化应激反应。为了探讨氧化应激的潜在作用，作者在共培养系统中加入 NAC 并评估其对 CDC6 介导细胞衰老的影响。结果显示，NAC 处理显著减少了 CDC6 过表达肿瘤细胞共培养成纤维细胞中的衰老标志物和 SASP 因子的表达（图 H），同时 SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例也显著降低（图 I）。最后，在 PC 的异种移植小鼠模型中，作者发现高 CDC6 表达与更严重的成纤维细胞衰老和较差的 ICI 治疗反应相关（图 J）。这些结果表明，CDC6 通过调控 TGF-β1 分泌和氧化应激，促进成纤维细胞衰老，从而影响 ICI 应答。

研究总结：

本研究揭示了肿瘤细胞来源的 CDC6 通过分泌 TGF-β1 和诱导氧化应激驱动成纤维细胞衰老的机制，并且明确了这种衰老状态对TME和ICI反应的重要影响。研究表明，成纤维细胞衰老通过重塑 TME，促进肿瘤进展和免疫抑制，而 FSS作为一个新的泛癌转录组学标志物，不仅可以有效预测患者的生存结局，还可用于评估 ICI 疗效。通过分析 40 个泛癌 scRNA-seq 数据集和 TCGA 泛癌数据集，FSS 展现了其在评估肿瘤促生长信号、免疫抑制状态及患者抗肿瘤免疫力方面的强大能力。此外，作者通过 CRISPR/Cas9 数据筛选发现 CDC6 是 FSS 中的核心基因，其在肿瘤细胞中过表达显著促进成纤维细胞衰老，并通过 TGF-β1 信号和氧化应激机制重塑 TME，削弱了免疫治疗效果。进一步通过高通量虚拟筛选，鉴定出潜在的 CDC6 抑制剂，这为靶向 CDC6 提供了新的治疗策略。综上所述，本研究利用大量的生信分析以及部分湿实验，不仅深化了对成纤维细胞衰老在癌症免疫抑制中的作用机制的理解，还为改善免疫治疗反应提供了潜在的靶点和治疗策略。