蛋白质组与代谢组相结合：分析不同生长阶段苜蓿营养变化的内在原因
英文题目：Proteomicsintegrated with metabolomics: analysis of the internal causes of nutrientchanges in alfalfa at different growth stages
中文题目：蛋白质组与代谢组相结合：分析不同生长阶段苜蓿营养变化的内在原因
期刊：BMC Plant Biology，2018，IF=3.9
研究材料：苜蓿
技术平台：LC-MS/MS
方案设计：
1.对萌芽期和开花中期的苜蓿叶片进行蛋白质组检测，并进行差异分析；
2.对萌芽期和开花中期的苜蓿叶片进行代谢组组检测，并进行差异分析；
3.差异代谢物与差异蛋白进行关联分析，发现苯丙烷通路发生了明显变化；
研究摘要：
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上种植最广泛的豆科饲料作物。具有高蛋白质，氨基酸，维生素和矿物质含量。紫花苜蓿被称为“草料之王”，因为它的叶子具有很高的营养价值。然而，苜蓿干草的营养价值受许多因素的影响，包括收获期。在萌芽阶段收获的紫花苜蓿叶产量高于茎产量，但早期花叶和茎产量几乎相同。许多研究人员还报道了在成熟阶段收获的苜蓿草料中粗蛋白质（CP）降低和纤维含量增加。目前认为在早花阶段收获苜蓿草料可以获得高产量和营养物浓度。然而，这在中国很难实现，由于温带半干旱的大陆性气候和缺乏机械设备，苜蓿总是从萌芽阶段收获到中期开花期。在此期间，许多代谢物和营养素，尤其是蛋白质，可能会减少，导致相对饲料价值（RFV）降低，这是一种广泛接受的饲料质量指数，表明对高质量生产的影响很大苜蓿干草和畜牧业的稳定和可持续发展。
研究结果：
1.苜蓿叶片营养成分分析
为了评估不同阶段叶子的组成，确定并记录主要营养指标。 粗蛋白（CP）分析表明，苜蓿叶片CP含量在萌芽期最高，为29.00，在开花期中期最低，为26.84。 这些结果表明叶片的CP含量从萌芽到开花中期继续减少。 相反，开花中期的中性洗涤纤维（NDF）含量为22.43，显着高于开花初期和萌芽期（P<0.05）。 萌芽期和早花期酸性洗涤纤维（ADF）含量差异不显着，显着低于开花期（P>0.05）。 纤维分析表明，苜蓿叶片的NDF和ADF逐渐增加。 因此，这些因素导致苜蓿饲料相对价值（RFV）从萌芽期到中期开花期下降。
2. 不同发育阶段紫花苜蓿的蛋白谱分析
对两个发育阶段的苜蓿叶片进行蛋白质组学分析，LC-MS/MS进行质谱鉴定，MASCOT进行Uniprot数据库搜索。差异选择FC值为1.2倍，共鉴定415中蛋白质。与萌芽期相比，花发育中期的叶片中256个下调，159个上调。GO分析发现，415个差异蛋白分类到生物过程，细胞组分，分子功能三个类别上。BP类别的主要功能类别是代谢过程。 对于MF，催化活性，结合和转运蛋白活性是最丰富的类别。 细胞，细胞器和膜类别是CC下最丰富的类别。对差异蛋白进行KEGG注释，注释到173个通路上。这些蛋白质主要分布在谷胱甘肽代谢，苯丙烷类生物合成，光合作用，碳代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢，氨基酸生物合成等类别（图1）。 这些结果表明，苜蓿营养质量相关的参与合成和代谢的蛋白质发生了变化。
3. 不同发育阶段的紫花苜蓿的代谢谱分析
对不同发育阶段的苜蓿叶片进行代谢物检测，OPLSDA模型VIP>1和P值<0.05的标准进行差异代谢物筛选。筛选到49种差异代谢物，并对差异代谢物进行分层聚类分析（图2）。这些代谢物主要包括氨基酸，有机酸，碳水化合物，嘌呤，脂质和嘧啶。共有24种代谢物在开花时上调，而25种在开花时下调。 L-谷氨酸，L-天冬酰胺，嘌呤，嘧啶和其他蛋白质合成相关代谢物的表达水平下调，而L-苯丙氨酸和碳水化合物，脂质和其他物质显着上调。对差异代谢物进行KEGG分析发现，差异表达的代谢物主要参与次生代谢产物的生物合成，蛋白质的消化和吸收，氨基酸的生物合成和苯丙素的生物合成这些代谢物的变化为我们研究紫花苜蓿营养品质的变化提供了重要信息。
4.蛋白代谢的联合分析
将蛋白质组学和代谢组学结果进行关联，本文选择代谢通路为载体。根据差异蛋白质和差异代谢物的进行作图分析。57个代谢途径的匹配显示出变化。对这些差异代谢途径的进一步分析表明它们主要参与能量代谢。选择了与苜蓿相关的营养代谢相关的代谢途径，氨基酸的生物合成，苯丙烷类生物合成以及淀粉和蔗糖代谢等（图3）。具有不同丰度的蛋白质和代谢物主要定位于KEGG中的苯丙烷类生物合成途径（图7）。参与苯丙烷类生物合成的蛋白质和代谢产物从出芽到开花中期非常活跃，其中L-苯丙氨酸，β-葡萄糖苷酶和肉桂醇 - 醇脱氢酶上调，4-羟基肉桂酸，咖啡酸3-O-甲基转移酶和咖啡酰-CoA O-甲基转移酶下调。
创新点：
蛋白组和代谢组联合分析解析影响苜蓿叶片的营养品质的因素，蛋白和代谢相对于基因组和转录组来说，更接近于植物的表型，所以对于研究牧草品质也更有说服力。
