操作步骤
1. 请自行准备:无水乙醇、1.5mL 离心管。
2. 取出洗涤液,按以下操作:
a) 洗涤液 A:按终浓度 30%比例加入无水乙醇,如 7mL 加入 3mL 无水乙醇;21mL 加入 9mL 无水乙醇,充分混匀。
b) 洗涤液 B:按终浓度 70%比例加入无水乙醇,如 3mL 加入 7mL 无水乙醇;9mL 加入 21mL 无水乙醇,充分混匀。
c) 配制好的洗涤液如出现沉淀,可在 37℃溶解,摇匀后使用。
3. 取 1.5mL 离心管,加入 200μL 样本,4μLDNACarrier 混合均匀,再加入 200μL 裂解液及 20μL 消化液,振荡混匀,65℃水浴 10 分钟。
4. 加入 0.9mL 无水乙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响 DNA 的提取与后续实验。
5. 将吸附柱放入收集管内,将 700μL 上述溶液转入吸附柱内,12,000 rpm 4℃离心 1 分钟,弃收集管内废液;
6. 将吸附柱放回收集管内,将剩余溶液转移至吸附柱内,重复步骤 5。
7. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
8. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
9. 将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 离心 3 分钟,离去残留的洗涤液。同时,按每份样本 30μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 300μL洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热 2 分钟。
10. 取出吸附柱,放入新的 1.5 mL 离心管内,加入上述已预热的 30μL 洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 2 分钟,收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项:
1. 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛,请立即用
清水或生理盐水冲洗,必要时请就医。
2. 裂解液如有白色絮状物析出属正常现象,置于 37℃水浴中溶解即可。
3.为提高提取的 DNA 浓度,可以减少洗脱液用量,但最低不要少于 15μL 。