目录：
1. 原理介绍
2. 操作演示
3. 关于Harmony操作是否会对差异分析产生影响
1. 原理介绍
官网：https://github.com/immunogenomics/harmony
（Harmony必须在R版本3.4以上运行，支持 Linux, OS X, and Windows 平台。）
文章：https://www.biorxiv.org/content/early/2018/11/04/461954
harmony算法与其他整合算法相比的优势：
（1）整合数据的同时对稀有细胞的敏感性依然很好；
（2）省内存；
（3）适合于更复杂的单细胞分析实验设计，可以比较来自不同供体，组织和技术平台的细胞。
基本原理：我们用不同颜色表示不同数据集，用形状表示不同的细胞类型。首先，Harmony应用主成分分析（一文看懂PCA主成分分析）将转录组表达谱嵌入到低维空间中，然后应用迭代过程去除数据集特有的影响。
（A）Harmony概率性地将细胞分配给cluster，从而使每个cluster内数据集的多样性最大化。
（B）Harmony计算每个cluster的所有数据集的全局中心，以及特定数据集的中心。
（C）在每个cluster中，Harmony基于中心为每个数据集计算校正因子。
（D）最后，Harmony使用基于C的特定于细胞的因子校正每个细胞。由于Harmony使用软聚类，因此可以通过多个因子的线性组合对其A中进行的软聚类分配进行线性校正，来修正每个单细胞。
重复步骤A到D，直到收敛为止。聚类分配和数据集之间的依赖性随着每一轮的减少而减小。
2. 操作演示
R包安装
library(devtools)
install_github("immunogenomics/harmony")
安装过程可能包括从源代码编译C++代码，因此可能需要几分钟。
下载稀疏矩阵示例(https://www.dropbox.com/s/t06tptwbyn7arb6/pbmc_stim.RData?dl=1)
library(Seurat)
library(cowplot)
library(harmony)
load('data/pbmc_stim.RData') #加载矩阵数据
#在运行Harmony之前，创建一个Seurat对象并按照标准PCA进行分析。
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = cbind(stim.sparse, ctrl.sparse), project = "PBMC", min.cells = 5) %>%
Seurat::NormalizeData(verbose = FALSE) %>%
FindVariableFeatures(selection.method = "vst", nfeatures = 2000) %>%
ScaleData(verbose = FALSE) %>%
RunPCA(pc.genes = pbmc@var.genes, npcs = 20, verbose = FALSE) #R语言中%>%的含义是什么呢，管道函数啦，就是把左件的值发送给右件的表达式，并作为右件表达式函数的第一个参数。
pbmc@meta.data$stim <- c(rep("STIM", ncol(stim.sparse)), rep("CTRL", ncol(ctrl.sparse)))#赋值条件变量
未经校正的PC中的数据集之间存在明显差异：
options(repr.plot.height = 5, repr.plot.width = 12)
p1 <- DimPlot(object = pbmc, reduction = "pca", pt.size = .1, group.by = "stim")
p2 <- VlnPlot(object = pbmc, features = "PC_1", group.by = "stim", pt.size = .1)
plot_grid(p1,p2)
Run Harmony
运行Harmony的最简单方法是传递Seurat对象并指定要集成的变量。RunHarmony返回Seurat对象，并使用更正后的Harmony坐标（使用Harmony代替PCA）。将plot_convergence设置为TRUE，这样我们就可以确保Harmony目标函数在每一轮中都变得更好。
RunHarmony函数中主要参数：
- group.by.vars参数是设置按哪个分组来整合
- max.iter.harmony设置迭代次数，默认是10。运行RunHarmony结果会提示在迭代多少次后完成了收敛。
- ⚠️
lambda参数，默认值是1，决定了Harmony整合的力度。lambda值调小，整合力度变大，反之。（只有这个参数影响整合力度，调整范围一般在0.5-2之间）- ⚠️
theta参数：Diversity clustering penalty parameter. Specify for each variable in group.by.vars. Default theta=2. theta=0 does not encourage any diversity. Larger values of theta result in more diverse clusters. 这个参数我常用默认值，但在不同文献中这个参数往往不同。- ⚠️
dims.use参数：Which PCA dimensions to use for Harmony. By default, use all.- sigma参数：Width of soft kmeans clusters. Default sigma=0.1. Sigma scales the distance from a cell to cluster centroids. Larger values of sigma result in cells assigned to more clusters. Smaller values of sigma make soft kmeans cluster approach hard clustering.
options(repr.plot.height = 2.5, repr.plot.width = 6)
pbmc <- pbmc %>%
RunHarmony("stim", plot_convergence = TRUE) #Harmony converged after 8 iterations
Harmory运行后的结果储存在：
pbmc@reductions$harmony
使用Embeddings命令访问新的Harmony embeddings。
harmony_embeddings <- Embeddings(pbmc, 'harmony')
harmony_embeddings[1:5, 1:5]
让我们查看确认数据集在Harmony运行之后的前两个维度中得到很好的整合。
options(repr.plot.height = 5, repr.plot.width = 12)
p1 <- DimPlot(object = pbmc, reduction = "harmony", pt.size = .1, group.by = "stim")
p2 <- VlnPlot(object = pbmc, features = "harmony_1", group.by = "stim", pt.size = .1)
plot_grid(p1,p2)
Downstream analysis
许多下游分析是在低维嵌入而不是基因表达上进行的。要使用校正后的Harmony embeddings而不是PC，设置reduction ='harmony'。
pbmc <- pbmc %>%
RunUMAP(reduction = "harmony", dims = 1:20) %>%
FindNeighbors(reduction = "harmony", dims = 1:20) %>%
FindClusters(resolution = 0.5) %>%
identity()
在UMAP embedding中，我们可以看到更复杂的结构。由于我们使用harmony embeddings，因此UMAP embeddings混合得很好。
options(repr.plot.height = 4, repr.plot.width = 10)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", group.by = "stim", pt.size = .1, split.by = 'stim')
TSNE分析
pbmc=RunTSNE(pbmc,reduction = "harmony", dims = 1:20)
TSNEPlot(object = pbmc, pt.size = 0.5, label = TRUE,split.by='stim')
两样本合并的TSNE和UMAP图
DimPlot(pbmc, reduction = "umap",pt.size = .1, label = TRUE)
TSNEPlot(pbmc, pt.size = .1, label = TRUE)
随后就可以寻找差异表达基因并对细胞进行注释。
3. 关于Harmony操作是否会对差异分析产生影响
Harmony输入的是scRNA@reductions$pca的数据，得出的结果储存在scRNA@reductions$harmony中。
而差异分析使用的是scRNA@assays$RNA@counts数据，互不影响。
4. 多样本批次矫正方法汇总
| 工具 | Batch-effect-corrected output | 方法 | |
|---|---|---|---|
| Seurat2 | R | Normalized canonical components | Canonical correlation analysis and dynamic time warping |
Seurat3 |
R | Normalized gene expression matrix | CCA and mutural nearest neighbors-anchors |
Harmony |
R | Normalized feature reduction vectors | Iterative clustering in dimensionally reduced space |
MNN Correct |
R | Normalized gene expression matrix | Mutual nearest neighbor in gene expression space |
| fastMNN | R | Normalized principal components | MNN in dimensionally reduced space |
| ComBat | R | Normalized gene expression matrix | Adjusts for known batches using an empirical Bayesian framework |
| limma | R | Normalized gene expression matrix | Linear model/empirical Bayes model |
| scGen | R | Normalized gene expression matrix | Variational auto-encoders neural network model and latent space |
| Scanorama | R/P | Normalized gene expression matrix | Mutual nearest neighbor and panoramic stitching |
| MND-ResNet | P | Normalized principal components | Residual neural network for calibration |
| ZINB-WaVE | R | Normalized gene expression matrix | Zero-inflated negative binomial model, extension of RUV model |
| scMerge | R | Normalized gene expression matrix | Stably expressed genes (scSEGs) and RUVIII model |
LIGER |
R | Normalized feature reduction vectors | Integrative non-negative matrix factorization (iNMF) and joint clustering + quantile alignment |
BBKNN |
P | Connectivity graph and normalized dimension reduction vectors (UMAP) | Batch balanced k-nearest neighbors |
