J Hepatol | 细胞外囊泡驱动肿瘤干细胞、肿瘤发生和转移

原创 榴莲不酥 图灵基因 2022-01-03 18:15

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：榴莲不酥

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亮点：

细胞外囊泡（EV）在连接肿瘤细胞及其局部和远处微环境方面发挥着关键作用。本文研究表明，EV-pIgR激活PDK1/Akt/GSK3β/β-连环蛋白信号级联，促进受体肝癌细胞的癌症干性和癌变表型；使用索拉非尼和抗pIgR抗体的联合治疗减弱了小鼠异种移植物的生长；肿瘤微环境中EV-pIgR介导的细胞间通讯的阻断可能为癌症患者提供新的治疗策略。

2021年12月16日，在Journal of Hepatology杂志上发表了一篇名为“Patient pIgR-enriched extracellular vesicles drive cancer stemness, tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma”的文章，研究阐明了EV-pIgR在调节癌症干性和侵袭性方面的作用。患者来源的EV具有增强的pIgR表达，是HCC肿瘤干细胞和肿瘤发生的关键介质。EV-pIgR通过激活β-catenin发挥致癌功能，用中和抗体阻断EV-pIgR是一种治疗肝癌的一种新选择。

肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的大部分，目前是全球癌症相关死亡的第四大原因。HCC通常在晚期被诊断出来，无法进行治愈性手术切除。晚期HCC的治疗选择在可用性和有效性方面受到限制。因此，了解HCC如何获得侵袭性特征对于改变早期诊断和治疗的现状非常重要。

越来越多的证据表明，细胞间通讯不仅由直接的细胞接触和可溶性因子介导，而且还由细胞外囊泡（EV）介导。EV是膜衍生的纳米级囊泡，其功能是将供体细胞衍生的生物活性分子转移到受体细胞中。显然，癌细胞衍生的EV是连接肿瘤细胞及其局部和远处微环境的关键信使，并协调多种全身病理生理过程以促进癌症进展。

聚合免疫球蛋白受体（pIgR）在粘膜上皮细胞中广泛表达，其调节二聚体IgA和五聚体IgM的转胞吞作用，它们是针对初始感染的一线抗体。pIgR的表达被认为是促炎性上调病毒或细菌感染时的细胞因子，从而连接先天免疫和适应性免疫。然而pIgR在肿瘤细胞中的临床相关性和功能仍不确定。有趣的是，研究尚未报告由肿瘤来源的EV中表达的pIgR介导的功能作用和信号通路。

研究团队首次将pIgR确定为对来自HCC患者的循环EV产生致癌作用的一种关键因子，本研究的结果揭示了富含pIgR的EV在增强癌症干性和侵袭性方面的作用，并提供了对pIgR作为HCC有希望的生物标志物和治疗靶点的临床相关性的见解。他们从患者的血清中分离、量化和表征EV。通过各种功能分析对EV进行了体外和体内严格测试。进行蛋白质组学分析以鉴定EV的功能成分。通过ELISA、免疫印迹、免疫组织化学和定量PCR确定循环EV以及HCC患者的肿瘤和非肿瘤组织中pIgR的存在和水平。具体研究如下：

HCC细胞系来源的EVs已被证明在增强HCC侵袭性方面发挥关键作用，然而它们对患者的功能影响的生理相关性仍然不明确。循环EVs收集自健康个体（Normal-EVs）、慢性HBV感染（HBV-EVs）、HBV相关肝硬化（Cirrhosis-EVs）、早期HCC（E-HCC-EVs）或晚期HCC（L-HCC-EVs）。与正常、肝硬化和E-HCC-EV相比，L-HCC-EV在促进细胞迁移、侵袭和集落形成和促进肿瘤发展方面表现出最高的效力。在原位肝移植模型中，重复注射L-HCC-EVs进入小鼠导致肝肿瘤形成和远处肺转移增强。在涉及共注射EV和鼠p53-/-中，Myc转导的肝母细胞的实验性转移测定中观察到L-HCC-EVs在促进转移方面的一致作用。L-HCC-EVs可以降低HUVEC中紧密连接蛋白VE-钙粘蛋白的表达并增强小鼠的内皮通透性。这些发现表明，促进转移可能归因于L-HCC-EVs诱导的肺血管系统渗漏，从而促进肿瘤细胞在肺中的外渗和定植。图1：HCC患者来源的EVs促进HCC细胞的侵袭性表型

除了调节肿瘤细胞的癌症表型外，L-HCC-EVs还增加了HCC细胞的癌症干性特性。用L-HCC-EVs而不是Normal-EVs处理的HCC细胞在球体形成试验中显示出形成肿瘤球的能力显著增加和癌症干细胞标志物CD90和CD133的表达增强。此外，L-HCC-EVs降低了细胞对索拉非尼的敏感性。在NOD/SCID小鼠中进行的有限稀释分析表明，与用PBS处理的细胞相比，用L-HCC-EVs处理的HCC细胞的致癌性显著增强，肿瘤发生率增加，肿瘤潜伏期缩短。L-HCC-EV处理的细胞的自我更新能力进一步加速。在初次和二次植入后，L-HCC-EV处理的细胞显示出比用PBS或Normal-EVs处理的细胞显著更差的无肿瘤存活率。图2：HCC患者来源的EVs促进HCC细胞的癌症干性

为了确定健康对照和患者的EV之间生物活性的差异，研究团队比较了它们的蛋白质组学特征。在L-HCC-EV与正常EV相比至少被调节2倍的候选物中，选择了与HCC相关的pIgR进行进一步研究。免疫印迹证实了E-HCC-和L-HCC-EV中pIgR的上调。在一组患者的循环EV中始终检测到pIgR的显著增加，手术后72%患者的EV-pIgR水平降低。免疫标记显示CD63+循环EV表面存在pIgR。在来自转移性HCC细胞的EV中检测到的pIgR水平高于来自正常肝脏和非转移细胞的EV。在HCC细胞系的转录物和蛋白质水平上也观察到了类似的pIgR表达谱。在植入源自转移性MHCC97L细胞的肿瘤种子的小鼠中，循环EV-pIgR的水平在肿瘤发展过程中逐渐增加。这些数据表明，肿瘤可能是EV-pIgR的主要来源，其水平可能是肿瘤发展的一个指标。与EV-pIgR相似，与非肿瘤组织相比，肿瘤组织中总体pIgRmRNA表达显著着上调。值得注意的是，pIgR转录产物在56%的HCC患者中上调。在包含143个配对HCC样本的组织微阵列中，在91.6%的肿瘤组织中检测到pIgR的强和中度阳性染色，而在62.9%的非肿瘤组织中检测到pIgR阳性染色显示弱阳性或阴性染色。H分数显示pIgR在肿瘤组织中具有显著更高的免疫反应性。在77.6%的病例中发现pIgR频繁过度表达。图3：pIgR在HCC患者的循环EV中上调

由于EV表面存在pIgR，研究团队又检查了针对pIgR的中和抗体是否能够阻断L-HCC-的促进作用。事实上，用抗pIgR抗体共同处理阻断了L-HCC-EVs在增强PLC/PRF/5细胞集落形成、迁移和侵袭方面的作用。此外，在p53-/-小鼠实验性转移测定中，与抗pIgR抗体共注射显著阻碍了由L-HCC-EV诱导的Myc转导的肝母细胞。抗pIgR抗体还消除了L-HCC-EVs在促进体外自我更新能力和表达CD90和CD133的PLC/PRF/5细胞百分比和抑制敏感性方面的作用。这些发现表明，来自HCC患者的循环EV通过pIgR的功能增强了细胞的癌症干性特性。图4：pIgR在功能上负责HCC患者来源的EV的促进作用

为了确定pIgR在EV中的功能作用，使用CRISPR协同激活介质（SAM-pIgR）和EV靶向表达载体（XP-pIgR）在Huh7细胞中稳定表达pIgR。pIgR-EVs能够促进鼠p53-/-的转移。此外，XP-pIgR-EVs促进体外自我更新能力，增加表达CD90和CD133的PLC/PRF/5群体并抑制HCC细胞对索拉非尼的敏感性。连续移植试验表明，用PBS或XP-CTL-EVs与原代异种移植物相比，XP-pIgR-EV处理的细胞在二次植入物中的自我更新能力进一步增强。XP-pIgR-EV处理的细胞显示出比用PBS或XP-CTL-EV处理的细胞更差的无肿瘤存活率。总之，这些发现表明EV-pIgR的功能能力与临床结果一致，表明HCC患者中EV-pIgR上调，数据表明富含EV的pIgR在促进HCC侵袭性方面具有以前未被发现的作用。图5：EV-pIgR通过PDK1/Akt/GSK3β信号激活β-catenin信号

在用Normal-EVs和L-HCC-处理的PLC/PRF/5和Huh7细胞中分析了参与癌症干性和耐药性调节的基因的表达。L-HCC-EVs在激活β-catenin表达方面发挥了最强大的作用，突出了其促进恶性肿瘤的潜力。TOP/FOP报告系统证明了L-HCC-EV对β-连环蛋白活性的激活。这些观察结果通过免疫荧光显微镜进一步证实，该显微镜显示在用具有增强的pIgR表达的EV处理后，HCC细胞中β-连环蛋白的核转位显著增加。值得注意的是，该L-HCC-EVs激活的β-catenin的核转位受到内吞抑制剂细胞松弛素D的抑制，表明EVs通过内吞作用被细胞吸收。图6：富含pIgR的EV通过PDK1/Akt/GSK3β轴激活β-catenin信号通路

PDK1的磷酸化导致Akt的激活，随后磷酸化GSK3β引起β-连环蛋白的稳定和核易位。XP-pIgR-EVs增加了PDK1、Akt和GSK3磷酸化并且这种激活被细胞松弛素D阻断。在PLC/PRF/5细胞中，由XP-pIgR-EV诱导的Akt和GSK3β的磷酸化被Akt抑制剂IV和β-连环蛋白抑制剂PRI-724减弱。在功能上，用这些抑制剂治疗消除了XP-pIgR-EVs对HCC细胞生长和运动的促进作用。此外，XP-pIgR-EVs对PLC/PRF/5细胞的体外自我更新能力、CD90+和CD133+细胞百分比以及细胞对细胞的敏感性的影响索拉非尼通过与抑制剂的共同处理而减少。这些发现表明富含pIgR的EV通过PDK1/Akt/GSK3β/β-catenin促进癌症和癌症干细胞特性。图7：用pIgR中和抗体靶向EV-pIgR是HCC的潜在治疗选择

在植入表达pIgR的PDTX的小鼠中测试了抗pIgR抗体和索拉非尼的治疗效果。与载体治疗相比，抗pIgR抗体或索拉非尼的给药抑制了肿瘤生长。值得注意的是，索拉非尼和抗pIgR抗体联合治疗在抑制肿瘤形成方面发挥了最有效的作用。但是没有观察到痛苦的迹象或身体的显著变化。在接受索拉非尼和抗pIgR抗体联合治疗的小鼠中，解剖肿瘤的重量和尺寸显著降低。免疫组织化学分析显示，不同治疗组的肿瘤中细胞pIgR表达没有变化，表明pIgR中和抗体通过靶向EV-pIgR而不是内源性pIgR起作用。图8：使用索拉非尼和pIgR中和抗体有效地抑制了病人来源的肿瘤异种移植的发展

总之，本研究提供了令人信服的证据，表明具有增强pIgR表达的患者来源的EVs作为HCC癌症干性和肿瘤发生的关键介质，还证明EV-pIgR通过激活β-catenin发挥致癌功能，并且用中和抗体阻断EV-pIgR是一种治疗选择。

教授介绍

Judy Wai Ping Yam博士，香港大学助理教授，人类癌症分子生物学领域的专家、研究员和作者。获得卫生及医学研究基金，ITC-创新和技术支持计划种子项目和国家自然科学基金等多项资助，并于2008-2009年获得香港大学杰出青年研究员奖。研究方向主要为肿瘤来源的细胞外囊泡在癌症转移中的功能作用，细胞外囊泡在转移前生态位形成中的作用，由肿瘤衍生的细胞外囊泡驱动的肝癌转移的信号通路，细胞外囊泡作为治疗递送载体的应用。研究旨在为改善癌症患者的临床管理做出贡献，并为新疗法的开发提供见解。

参考文献

Tey SK, Wong SWK, Tung Chan JY, et al.Patient pIgR-enriched extracellular vesicles drive cancer stemness,tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2021 Dec16:S0168-8278(21)02245-5. doi: 10.1016/j.jhep.2021.12.005. Epub ahead of print.PMID: 34922977.