设计引物的四种方法：
1.查询相关SCI文献（IF=5.0以上）
2.查询在线的引物数据库
3.NCBI在线设计和验证（Primer-BLAST）
4.软件设计（Primer6，Oligo7）
一、查询相关SCI文献（IF=5.0以上）
在NCBI的Pubmed上查询相关SCI文献，序列会出现在文献里面的附件里或者是实验方法那一部分。
二、查询在线的引物数据库
Primerbank：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
公司资源库：https://www.origene.com/
公司资源库很靠谱，但只有人和小鼠的。
公司给出的引物序列都是很靠谱的，因为都是测过好多次的。
三、NCBI在线设计和验证（Primer-BLAST）
以ACE2为例。
（1）NCBI官网获得基因序列或cDNA序列
基因序列用作普通PCR扩增，cDNA序列用作qPCR（荧光定量PCR）扩增。
通常第一个是人的基因，后面是其他物种的基因。这里以人的基因为例。
普通PCR
以ACE2的整个基因组为模板。
因为前面选择的是Refseq数据库的参考序列，所以这里显示的是Refseq。
9606是人的一个编号。
这里是根据序列信息默认填上的，不用修改。
可以点击在新窗口显示结果。
最后Get Primers。
qPCR
以mRNA为模板。
一共有6个转录本。
qPCR产物的大小需要修改为150-250。
qPCR的退火温度最小值需要修改为55.0，最大值需要修改为65.0。
最下面的红色框是选择是否需要跨越两个外显子。最后的结果大部分都会跨越。
（2）设计引物
普通PCR
可以看到有18个外显子序列，设计了10对引物。
这10对引物集中在第17个外显子和第17个内含子区域。
qPCR
这是第三个转录本，一般最好选择第一个转录本。
（3）挑选合适的引物
（4）验证引物特异性
