以下是一些用于检测PCR产物特异性的常见方法:
q PCR引物的设计工具:
NCBI的primer-blast
IDT的primeTimqPCR Assay Design Tool.
凝胶电泳:凝胶电泳是一种广泛用于检测PCR产物特异性的方法。PCR产物基于大小在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上分离,然后使用DNA特异性染料或乙溴化乙锭染色进行可视化。特异的PCR产物应该在凝胶上呈现为单一的带状条纹。
DNA测序:DNA测序是一种高度精确的检测PCR产物特异性的方法。PCR产物被扩增并使用Sanger测序技术进行测序,可以确定扩增产物的确切序列。然后可以将序列与目标序列进行比较,以确认特异性。
限制性内切酶切割:限制性内切酶切割可以用于检测PCR产物特异性。PCR产物经过识别产物特定序列的限制性内切酶切割。如果产物是特异的,则应产生独特的限制性片段模式。
熔解曲线分析:熔解曲线分析可以用于检测PCR产物特异性。PCR产物被变性,然后在监测荧光强度的同时重新退火。特异的PCR产物应具有可区分于非特异产物的独特熔解温度(Tm)。
杂交探针:杂交探针是荧光标记的寡核苷酸,可与PCR产物内的特定序列杂交。通过使用针对PCR产物不同区域的不同探针,可以确认特异性。