基于CRISPR/Cas9系统的不同基因编辑方法已经广泛应用于哺乳动物细胞系中，而在鱼类细胞系中进行遗传操作的研究较少。利用CRISPR/Cas9进行细胞系基因编辑主要包括以下几个步骤：如靶向目的基因的gRNA设计、细胞转染、基因编辑效率的确定、单细胞克隆的建立，以及突变细胞系的特征鉴定等。每个过程都需要克服相应的障碍，特别是对于鱼类细胞系，以低转染效率闻名。相比哺乳动物细胞系，鱼类细胞系的培养温度较低、细胞膜磷脂饱和度较高，使得磷脂双分子层更加坚硬，外源DNA进入细胞更加困难。
虽然利用病毒载体进行质粒传递的方式具有较高的转染效率，但是病毒载体存在两个缺点：一是CRISPR/Cas9元件的长时间表达会导致脱靶效应的概率增加，二是病毒DNA可能会整合到宿主基因组中而导致插入突变事件。此外，由于鲑科鱼类细胞生长缓慢以及鱼类单克隆细胞系培养困难，此前还没有分离经过基因编辑的虹鳟鱼（Oncorhynchus mykis）克隆细胞系。为了便于在鱼类细胞系中进行遗传操作，瑞士联邦水产科学和技术研究所、苏黎世大学实验动物科学研究所及环境系统科学系的Marina Zoppo和Nicole Okoniewski等人在Cell & Bioscience期刊上发表了题为“A ribonucleoprotein transfection strategy for CRISPR/Cas9‐mediated gene editing and single cell cloning in rainbow trout cells”的研究论文。在本研究中，作者以在虹鳟鱼肠道细胞系RTgutGC中敲除cyp1a1基因为例，建立了一种基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑鱼类细胞系的方法，并获得了cyp1a1基因突变的单克隆细胞系。
本次实验中，研究人员使用了NEPA GENE NEPA21 对RTgutGC细胞进行电穿孔。为确定最适合RTgutGC细胞电穿孔的参数，设置了11次电穿孔条件，当参数为电压150V、脉冲时间5ms、脉冲间隔50ms、脉冲次数2次的程序时，转染效率最高，经过优化后标准质粒（pEGFP-C1-Flag）的转染效率可达到78%。
随后，研究人员先将cas9蛋白与crRNA:tracrRNA-ATTO™550双链合成核糖核蛋白（RNP）复合物（图1a）。采用上述电穿孔参数，对RTgutGC细胞进行电穿孔并将RNP复合物导入到细胞内，用以敲除cyp1a1基因（图1b）。电穿孔48h后，使用ATTO™550信号进行流式细胞仪分选，并在96孔板中培养后依次传到更大的细胞培养孔板上，以便提取细胞基因组DNA进行基因分型。最后，采用T7内切酶（T7EI）分析和ICE分析分别评估CRISPR/Cas9诱导的基因编辑效率和突变的性质，最后通过低密度接种和克隆环细胞分离法获得克隆细胞（图1b）。
图1 在RTgutGC细胞中转染核糖核蛋白（RNP）复合物。a. RNP的合成过程；b.细胞电转染及CRISPR/Cas9基因编辑流程。
研究人员对cyp1a1基因的crRNA分析表明，cyp1a3中存在一个假定的脱靶位点，cyp1a3是一个属于CYP1A亚家族的基因，与目标基因cyp1a1有96%的核苷酸同源性。但是在PAM近端区域存在单个碱基对错配，这表明可能不会发生脱靶切割现象。T7EI检测结果显示，未转染RNP的细胞cyp1a1扩增产物只有一条与野生型产物对应的DNA条带。但是转染RNP的细胞cyp1a1扩增产物被切割成三条带，对其DNA条带强度进行评估，cyp1a1的基因编辑效率约为39%（图2a-b）。此外，从转染RNP和未转染RNP细胞中扩增出cyp1a3基因，未检测到切割产物，表明结果与预期相符（图2b）。
此外，作者从转染和未转染的RTgutGC细胞中扩增出RNP复合体靶向的cyp1a1 DNA区域，并进行Sanger测序。结果表明，在crRNA靶向的区域有重叠的峰，进一步证实了cyp1a1基因的编辑（图2b）。同时，使用ICE分析表明，在Cas9切割位点检测到不同长度的基因插入或缺失（从−5核苷酸到+1核苷酸），与非同源性末端连接（NHEJ）修复途径相兼容（图2c）。ICE分析cyp1a1基因的总体编辑效率为34%，与Sanger测序之间具有良好的相关性（R2=0.98）。
图2 RTgutGC细胞转染后进行T7E1检测和ICE分析。a. 左侧为T7EI检测示意图；右侧为T7E1检测结果，（1）RNP转染组RTgutGC细胞的cyp1a1；（2）未转染组RTgutGC细胞的cyp1a1；（3）RNP转染组RTgutGC细胞的cyp1a3；（4）未转染组RTgutGC细胞的cyp1a3；（5）T7E1检测阳性对照；每个泳道上的数据为基因编辑效率。b. Sanger测序结果。c. 电转染RNP细胞的ICE分析结果。
值得一提的是，作者本想通过流式细胞仪分选法或连续稀释法分离出经基因编辑的RTgutGC细胞克隆，但均以失败告终。最后，采用了克隆环细胞分离法成功分离出两株cyp1a1基因突变的RTgutGC细胞系。作者分析可能主要存在两个因素：一是鱼类细胞系生长缓慢，二是细胞培养过程中需要其他细胞释放生长因子。经鉴定，两株cyp1a1基因突变细胞系分别在PAM序列之前的第3个核苷酸发生1个和101个核苷酸的插入，均导致了cyp1a1 ORF的移码，使得终止密码子提前。
在本研究中，作者借助NEPA21将RNP复合物导入难转染的鱼类细胞系RTgutGC中，成功地开发了一种CRISPR/Cas9方法来编辑虹鳟细胞系RTgutGC，以及一种分离经过基因编辑的克隆细胞的方法。这是首次报道虹鳟CRISPR编辑的克隆细胞系，为将来分离虹鳟鱼和其他鱼类细胞系的克隆细胞奠定了基础。NEPA21电转程序，电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式。
论文链接：
https://linkspringer.53yu.com/article/10.1186/s13578-021-00618-0
参考文献：
Zoppo M, Okoniewski N, Pantelyushin S, et al. A ribonucleoprotein transfection strategy for CRISPR/Cas9‐mediated gene editing and single cell cloning in rainbow trout cells[J]. Cell & Bioscience, 2021, 11(1): 103.
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