Part 4 DFI strengthens vaccine responses
Para1:
随着年龄的增加，T细胞介导的疫苗应答效应减弱。本研究选取成年（6周龄）和老年（72周龄）小鼠，以卵清蛋白作为模型抗原进行疫苗接种。结果发现，① 与成年组相比，老年组小鼠在接种疫苗后，脾脏和血液中产生的卵清蛋白特异性CD8+ T细胞数量非但没有增加，反而显著减少，与既往报道一致；② 当这些小鼠再次接触相同抗原时，其T细胞分泌的关键细胞因子IL-2和IFNγ水平也明显降低。总体而言，老年小鼠的这些免疫应答指标严重受损，其反应强度几乎与未接种疫苗的对照组老年小鼠处于同一水平，即是否接种疫苗对老年组无效 (Supplementary Fig. 3A–D)。但如果对老年小鼠进行疫苗接种前注射DFI，可增加老年小鼠脾脏和血液中总T细胞及CD8+ T细胞的数量(Fig. 3a–d)。基于此，本研究进一步探究DFI是否能逆转老年小鼠对疫苗的低应答状态。
- Fig 3a: 实验设计示意图。老年小鼠每周两次接受DFI或对照（Luc）mRNA-LNPs处理，持续28天，随后使用佐剂化OVA进行免疫
- Fig 3b: 小鼠脾脏中总T细胞数量，组间比较分析
- Fig 3c-d: 脾脏中SIINFEKL–H-2Kᵇ四聚体阳性CD8⁺ T细胞的频率及数量，组间比较分析
- Supplementary Fig 3A: 流式分选小鼠脾脏及外周血中SIINFEKL-H-2Kᵇ四聚体结合CD8⁺ T细胞（SIINFEKL：是一个来自卵清蛋白的特定肽段，作为模型抗原；H-2Kᵇ：是小鼠MHC I类分子，负责将肽段呈递给CD8⁺ T细胞→精确量化识别卵清蛋白的杀伤性T细胞，以此评估抗原特异性细胞免疫应答的效能）
- Supplementary Fig 3B: 小鼠皮下接种卵清蛋白肽疫苗的实验时间线，随后进行体外脾细胞SIINFEKL肽再刺激及细胞内细胞因子染色
- Supplementary Fig 3C: 外周血及脾脏中SIINFEKL-H-2Kᵇ四聚体结合T细胞的频率，以及体外SIINFEKL再刺激24小时后总T细胞计数相对于对照组的倍数变化。
- Supplementary Fig 3D: 体外SIINFEKL再刺激6小时后，脾细胞中IL-2与IFN-γ表达水平相对于对照组的倍数变化
Para2:
疫苗在老年小鼠中失效主要源于两方面：新生免疫细胞减少，以及现存细胞逐步转向功能失调状态。本研究发现，① 衰老小鼠体内确实会积累PD1高表达、CD62L阴性的T细胞 (Fig. 2a and Extended Data Fig. 1e,i)，且反复接种疫苗会进一步加剧该耗竭样表型的扩增，而成年小鼠无此现象(Fig. 3f)；② 经DFI预处理后接种疫苗，naïve T细胞比例得以维持，PD1高表达CD62L阴性T细胞数量减少(Fig. 3e–g)，表明免疫细胞组成趋向健康；③ 功能上，DFI处理小鼠的CD8****⁺ T细胞在抗原再刺激时能产生更高水平的IL-2和IFNγ，而CD4****⁺ T细胞的抗原特异性频率及相关细胞因子变化不显著(Fig. 3h and Supplementary Fig. 4a–e)。以上结果说明，DFI能优先支持并增强CD8****⁺ T细胞介导的疫苗免疫应答。
Tip: PD1高表达、CD62L阴性的T细胞是什么？
PD1high 表明这些细胞处于长期、慢性抗原刺激下，其增殖和效应功能已受到抑制；CD62L是介导淋巴细胞归巢至淋巴结的关键分子，其阴性表明该细胞已离开淋巴器官，进入外周炎症组织或血液循环。这两个组合代表了一群 “长期被抗原刺激、已迁移至外周、但功能逐渐衰竭的T细胞”。它们的扩增挤占了健康初始和记忆T细胞的空间，是导致疫苗应答无效的重要原因。
- Fig 3e: 脾脏中 naive T cells（CD44⁻CD62L⁺）的频率，组间比较
- Fig 3f: 脾脏中耗竭表型T细胞（CD62L⁻PD1high）的频率，组间比较
- Fig 3g: 重复OVA或假性（载体）疫苗接种后 naive T cells 与耗竭T细胞的比例及其比值
- Fig 3h: 功能性抗原回忆反应：经6小时 SIINFEKL 再刺激后，胞内因子IL-2（左）与 IFNγ（右）荧光强度变化。
- Supplementary Fig. 4A：实验流程图：为期28天的DFI或对照mRNA-LNP处理，随后进行佐剂化OVA蛋白皮下免疫实验，初次免疫后35天进行免疫应答分析
- Supplementary Fig. 4B：针对免疫优势OVA肽段OVA323-339特异的I-Aᵇ四聚体结合CD4⁺ T细胞的频率，组间比较
- Supplementary Fig. 4C-E：经体外OVA再刺激后，IFN-γ⁺、T-bet⁺及IL-17⁺ CD4⁺ T细胞的频率，组间比较
Para3:
本研究进一步延长了实验周期，在一项覆盖小鼠全生命周期的疫苗接种研究中，DFI治疗能使老年小鼠疫苗诱导的T细胞数量显著提升，达到与年轻得多的小鼠相近的水平，免疫应答能力恢复可恢复至约小鼠24-week的状态 (Fig. 3i)。
- Fig 3i: 测量了不同年龄下SIINFEKL–H-2K(b)四聚体阳性T细胞的频率，并对数据进行了拟合。基于此拟合出的标准曲线，进一步推算出经DFI或Luc mRNA-LNPs预处理的52周龄老年小鼠所对应的“免疫接种应答年龄”。
Para4:
综合以上结果，完整的DFI联合方案可有效逆转衰老相关的CD8+ T细胞疫苗应答缺陷。这一发现也印证了一个更广泛的免疫学原理：即使在衰老状态下，免疫系统在获得充分且适宜的刺激后，仍具备激发有效免疫应答的潜能。
