今天分享另外一篇植物单细胞的文献，发到了NP上，是关于长春花的。
其实我以前不知道什么是长春花，好像印象中也没见过。所以先百度百科了一下：
长春花，中药名。为夹竹桃科长春花属植物长春花Catharanthus roseus（L.）G. Don、黄长春花Catharanthus roseus（L.）G. Don. cv. Flavus的全草。植物长春花，我国华东、中南、西南有栽培。原产非洲东部；植物春长春花，产海南等地。具有解毒抗癌，清热平肝之功效。主治多种癌肿，高血压，痈肿疮毒，烫伤。
所以，这个应该是个药用植物，药用植物也进入了单细胞时代了。
取样：从幼嫩的长春花叶片制备高质量的原生质体上机建库测序。三个生物学重复。下图就是原生质体的情况。
下面就进入单细胞的常规分析了，看了文章，好家伙，还装了个三代基因组，糅合进了文章里面。
利用他们装好的三代基因组作为参考基因组，作者用Alevin分析获得了40530个cell，平均2239个基因表达。经过滤后，获得了34,39个高质量的cell（下图b）。然后聚类之后，获得了14个cluster。
下面就是，常规的细胞类型鉴定了，还是利用已知的marker基因（下图a）。不明白为啥要画2图，2c一个，3f一个。
通过RNA原位杂交技术验证了4个marker。（下图b、c、d、e）
春花能够合成130多种单帖吲哚生物碱（MIA），其中包括抗癌药物长春碱和长春新碱以及降压药物阿吗碱和蛇根碱等。因此，长春花被认为是研究MIA生物合成的模式植物。所以，作者特地查看了MIA合成途径相关的功能基因，看了下载细胞类型上的选择和表达情况。结果发现甲基赤藓糖醇（MEP）途径和环烯醚萜（Iridoid）途径相关基因高度富集，说明MIA骨架中的萜类部分可能是主要通过MEP途径在IPAP中合成的；而大多数甲羟戊酸（MVA）途径的相关酶基因主要在EC中表达，说明MIA合成途径的中间部分主要在EC中合成，包括从马钱苷酸甲基转移酶到长春质碱合酶和水甘草碱合酶的10余个酶，以及色氨酸脱氢酶。其他MIA分支途径的酶基因多在IC中高表达，提示途径的最后两步在IC中完成。
作者根据上述MIA合成相关的基因，总结了一张MIA合成通路的总结图，加上了发生的细胞部位。如图4b所示，作者发现在长春碱生物合成过程中，不同细胞类型之间的中间转运至少发生了三次，那么这些化合物是如何在不同细胞类型中转运的呢？作者提出，鉴定MIA转运中间体的细胞特异性候选体是更好地理解MIA转运机制及其在通路分隔中作用的一个重要入手点。然后作者从单细胞数据鉴定了相关的转运蛋白，分析了细胞类型特异的转运蛋白。通过细胞特异性表达分析和系统发育分析发现2个ABC、2个MATE和4个PUP可能参与了MIA中间产物的转运，其中CrMATE1、CrABCG8、CrNPF2.9和CrTPT2等主要与EC转运相关；多个PUP家族蛋白和CrMATE16等主要与IC转运相关；而在这些候选转运体中并没有发现IPAP特异性转运体。
在细胞类型鉴定时，EC被分为了未成熟EC1与成熟EC2两种不同的亚型。并且作者发现EC在MIA生成中起到至关重要的作用，因此作者对EC进行亚群再分群并通过拟时分析构建了细胞分化发育轨迹。从发育轨迹可以看出，发育轨迹从EC_2开始，其次是EC_3、EC_4和EC_1，而EC_0细胞则根据AMTL1和CER3的表达模式分布在轨迹的末端。
然后作者鉴定了影响分化轨迹的关键节点，并分成了4个module，每个module做了GO富集分析。分析结果表明：在发育轨迹起始阶段富集的基因主要参与分生组织生长调节和细胞生长过程，符合早期发育EC的生理状态，而在轨迹末端功能富集的基因主要参与蛋白质磷酸化和非生物应激反应，这与成熟表皮细胞响应环境刺激的高敏感性相一致。此外，大多数在EC中特异表达的MIA基因在EC发育的早期细胞中表达水平较高，沿轨迹表达量持续下降，其中TDC、CS、16OMT和T3O的表达大幅下降，在轨迹末端（成熟的EC）很少表达，只有PRX在EC发育后期表达水平略高。这一现象表明，在EC特异表达的MIA基因的活性受到EC发育的紧密调控。
然后，作者又分析了VC cell的轨迹分化状态，因为VC和植物生物碱运输和生物合成紧密相关。通过亚群再分群将VC划分为6个亚群，其中8_1亚群被注释为原形成层细胞，而8_2和8_5被注释为伴胞（companion cell, CC）。基于3个亚群构建了从原形成层到CC连续分化的拟时轨迹。GO富集分析结果显示，位于轨迹起点的基因注释结果与原形成层相关生理功能的细胞增殖和核小体组装等过程相一致，而糖摄取、离子运输以及能量需求等过程的注释基因均在轨迹末端富集，与CC的生理功能相一致。
此外，研究人员还比较了长春花叶片和拟南芥叶片以及拟南芥seedling（shoot apex和leaf）的单细胞转录组数据集，不仅验证了长春花细胞分群和注释的准确性，也证实了双子叶植物叶片进化的保守性。其中，跨物种细胞亚群聚类相关性分析显示长春花的未知细胞类型UN与拟南芥MC具有较高的相关性，表明在长春花叶片中未能鉴定出细胞类型的UN可能是一种叶肉细胞。哎，不过从相关系数来看，最高的也不过0.4，这都叫相关性高的话，我可能有点迷惑。因为我做的感觉0.75都觉得有点低呢。
