尽管在癌症生物学和治疗方面取得了重大进展，但膀胱癌（BC）患者的临床疗效仍不尽如人意。 肿瘤微环境（TME）是一个潜在的靶点。 在这里，通过对 8 个 BC 肿瘤样本和 3 个副肿瘤样本进行单细胞 RNA 测序，我们在 BC 微环境中发现了 19 种不同的细胞类型，这表明肿瘤内部存在高度异质性。 我们发现，肿瘤细胞下调了 MHC-II 分子，这表明癌细胞免疫原性的下调可能导致免疫抑制微环境的形成。 我们还发现，单核细胞在肿瘤区域发生 M2 极化并分化。 此外，LAMP3 + DC 亚群可能能够招募调节性 T 细胞，从而参与免疫抑制 TME 的形成。 通过使用包含 3000 多个 BC 样本的公开数据集进行相关性分析，我们确定了炎症性癌相关成纤维细胞（iCAFs）在肿瘤进展中的作用，这与不良预后密切相关。 此外，我们还描述了一个依赖于 iCAFs 的调控网络。 这些结果有助于阐明 iCAFs 的原癌机制。 我们的研究结果为癌症免疫学提供了深刻的见解，并为未来的药物发现提供了重要的资源。
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单细胞测序和细胞类型鉴定
经过质量控制和去除批次间的批次效应（补充图 1，见 "方法"），52721 个单细胞被聚类为八大细胞群。 簇的特异性基因被用于用先前研究中描述的经典标记注释细胞类型5：上皮细胞（EPCAM+）；内皮细胞（CD31+）；两种成纤维细胞（COL1A1+）-iCAFs（PDGFRA+）和 myo-CAFs（mCAFs）（RGS5+）；B 细胞（CD79A+）；骨髓细胞（LYZ+）；T 细胞（CD3D+）；肥大细胞（TPSAB1+）（图 1a、b 和补充图 2A-D）。 1a，b，补充图 2A-D）。
图1： a, b 鉴别 BC 和非恶性组织中的浸润细胞类型。 a 样品制备、测序和生物信息学分析的工作流程。 b 本研究中绘制的单个细胞的 tSNE 图，按主要细胞类型、肿瘤等级和患者着色。 c UMAP 图 EPCAM+ 细胞（上皮标记物）按群组、患者、分级和 CNV 级别着色。 d 每个 CNV 组的差异表达基因（DEG）热图。 e 恶性细胞中下调基因的丰富 GO 功能。 f MHC-II 分子和 CD74 的表达水平。 h 热图显示了不同 CNV 组间每个细胞的 GSVA 评分的通路活性差异。 所示为线性模型的 t 值。 癌细胞表现出高度异质性（CNV）
EPCAM+上皮细胞（EPCs）被重新聚类，产生了 17 个簇（图 1c，d）。 有趣的是，虽然之前已经消除了批次效应，但癌细胞仍显示出患者特异性表达模式，这表明异质性极高，可能是由拷贝数变异（CNV）引起的6；InferCNV 证实了这一假设（图 1c，补充图 3A）。 如补充图 3A 所示，CNVs 在大多数高级别肿瘤来源的 EPCs 中积累，并且在集群间表现出高度异质性。 尽管存在异质性，但几乎所有高级别癌细胞都存在 9 号和 11 号染色体缺失以及 19 号和 20 号染色体扩增。 此外，肿瘤组织中的一些细胞几乎没有 CNV，并显示出与正常 EPC 相似的表达模式（图 1d），这表明这些细胞可能是非恶性 EPC。 因此，本研究根据 CNV 将 EPC 分成 4 组：低、高、对照组和未检测到组。
在比较转录组时，我们注意到一系列基因在对照组和未检测到 CNV 的组别中表达量特别高，但在肿瘤细胞中几乎没有表达（图 1d，红色空白）。 基因本体富集分析表明，这些基因富集于免疫相关通路，尤其是 B 细胞相关通路（图 1e）。与正常上皮细胞相比，癌细胞几乎丧失了产生免疫球蛋白的能力，它们表达的 MHC-II 分子水平也较低，这一点通过免疫荧光得到了验证（图 1f，g）。 这些结果表明，膀胱癌细胞可能会降低免疫原性以逃避免疫检测。 此外，我们注意到，拥有更多 CNV 的癌细胞似乎表达更高水平的 IGF2（补充图 3B、C）。 在 TCGA BLCA 队列中，高水平的 IGF2 与预后不良显著相关（补充图 3C）。 利用基因组变异分析（GSVA）进行的通路分析显示，CNV高发组富集了E2F靶点、MYC靶点和G2M检查点通路，而炎症和其他免疫相关通路则下调（图1h）。 这些结果进一步证实，BC晚期癌细胞降低了免疫原性，并显示出较高的增殖能力。-
肿瘤区域: 单核细胞 M2 极化
髓系细胞的重新聚集确定了 7 种细胞类型： 肿瘤相关巨噬细胞 （TAM，MRC1+C1high）;CD1C+ 树突状细胞（CD1C+ DC、CD1C+CLEC10A+）;单核细胞 （S100A8+S100A9+）;增殖髓系细胞 （TOP2A+）;交叉呈递 DC （CLEC9A+）;滤泡 B 细胞 （CD79A+MS4A1+）;和 LAMP3+ DC （LAMP3+CCR7+）。这些细胞亚群通过流式细胞术证实（补充图 1）。两个细胞簇同时表达髓系标志物和上皮或内皮标志物，它们被认为是双联体（图 D）。2a，补充图5A-C）。细胞类型之间的差异也可以通过 TF 基序的活性来识别（补充图 1）。值得注意的是，单核细胞主要起源于正常粘膜组织，而 TAMs 在 BC 组织中富集。此外，这两种细胞类型的转录组似乎表现出持续的变化（图 D）。2b，补充图5B，红色空白），表明募集到肿瘤区域的单核细胞被重编程为 TAM，这之前已在小鼠乳腺癌模型7 中报道。为了进一步研究这一正在进行的过程，我们对单核细胞和 TAM 进行了轨迹分析和 RNA 速度分析8,9。在两个计算管道中都观察到了类似的现象（图 D）。2c 和补充图结合 SCENIC 鉴定的关键基序，我们认识到 BACH1、MAFG 和 NFE2 三个基序的活性下调，而 MAF、STAT1 和 STAT2 基序的激活导致了这种 M2 极化过程（图 D）。2c， d， 补充图这些结果为抑制或逆转免疫抑制微环境的形成提供了潜在的靶标。此外，我们注意到共抑制剂 CD274、LGALS9、CD276、TIGIT 和 PDCD1LG2 在这个分化过程中都上调，而共激活因子下调（图 D）。2e）。
图2: LYZ + 单细胞亚群的 tSNE 图。单核细胞和 TAM 之间的 b DEGs。红色空白的单个单元格显示两个组的特征。c 单片细胞 2 预测的从单核细胞分化为 TAM 的轨迹。d 在分化过程中由细胞簇着色时显着抑制或激活 TF 基序。e 热图显示分化过程中免疫检查点上调或下调。f 三个不同 DC 子组之间 DEG 的热图。g Violin 图显示细胞因子和 CD274 在 LAMP3+ DC 中高度表达的表达水平。h LAMP3+ DC 与 TCGA BLCA 队列中不同 T 细胞亚群之间的相关性。系数采用 spearman 相关分析计算。 LAMP3+ DC 通过细胞因子将 Treg 募集到肿瘤区域
在 3 个 DC 亚组中，LAMP3+ DC 表达编码细胞因子的各种基因，包括 CCL17、CCL19 和 CCL22（图 D）。引人注目的是，这些细胞因子几乎完全起源于 BC 中的 LAMP3+ DC （图 D）。如之前的研究中所讨论的，CCL17 和 CCL22 通过与 Tregs 膜上表达的 CCR4 结合而对 Tregs 具有很强的趋化性10,11。在 TCGA BLCA 队列中，LAMP3+ DC 特征与 Treg 特征和 Th2 特征高度正相关，两者都是 CCR4+，但与 CTL 特征没有高度相关性（图 D）。LAMP3 + DC 在肿瘤组织中显著富集（补充图 1）。此外，LAMP3+ DC 显示最高水平的 CD274 （图 D）。2f），这甚至高于在 BC 组织的 Tregs 中观察到的水平，表明该 DC 亚组可以直接或通过将 Treg 募集到肿瘤区域来抑制 CD8+ T 细胞。SCENIC 分析显示，RELB 和 KDM2B 基序在 LAMP3+ DC 中高度激活（补充图 D）。5E-G）。-
在 BC 中鉴定出两种不同的成纤维细胞亚型
成纤维细胞 （COL1A1+） 分为两种不同的类型：PDGFRA+ 成纤维细胞表现出各种细胞因子和趋化因子的强烈表达，包括 CXCL12、IL6、CXCL14、CXCL1 和 CXCL2，这与 Öhlund D 等人在胰腺癌模型中描述的 iCAF 相似12;RGS5 + 成纤维细胞具有类似于肌癌相关成纤维细胞 （mCAF） 的特征（图 D）。3a、b）。通过免疫荧光评估肿瘤和非恶性膀胱基质组织中现有的 iCAFs 和 mCAFs（图 D）。结果表明，CAFs 在癌症类型中具有相似的亚组12,13。
由簇 （上） 和亚组标记 （下） 着色的成纤维细胞的 tSNE 图。b 不同成纤维细胞亚组之间 DEG 的热图。c IF 证实存在 iCAF 和 mCAF （n = 30）。比例尺代表 50 μm。d iCAFs 和 mCAFs 中上调基因的 GO 功能丰富。e、f GSEA 显示了 iCAFs （3E） 和 mCAFs （3F） 中最富集的通路。NES 表示标准化富集分数。g Violin 图显示 CXCL12 在主要细胞类型的表达水平。h TCGA BLCA 队列中 CXCL12 水平与肿瘤浸润巨噬细胞的相关性。系数采用 spearman 相关分析计算。i 高水平的 CXCL12 预示着 TCGA BLCA 队列的预后不良。< 0.05 的 Log-rank p 值被认为具有统计学意义。j IF 识别 BC 组织中的 CXCL12 + iCAFs。iCAFs 是肿瘤组织中 CXCL12 的主要衍生物。比例尺代表 50 μm。
为了研究每个亚组的功能，我们对 iCAFs 和 mCAFs 的 DEGs 进行了 GO 富集分析。如图 1 所示。3d，iCAFs 与细胞外基质组织、细胞迁移调节和血管生成有关，而肌肉系统过程、黏着斑和细胞外基质相关通路在 mCAFs 中显著富集。GSEA 同样揭示了 iCAFs 与细胞外基质降解相关，表明在肿瘤转移中具有潜在作用。细胞因子-细胞因子受体相互作用通路也在 iCAF 中富集。相比之下，肌肉收缩和 PGC1A 通路在 mCAF 中富集，对应于之前的体外 12 研究（图12）。3e， f） 的
由于细胞因子-细胞因子受体相互作用在 iCAFs 中富集，因此我们研究了 BC TME 中细胞因子的表达水平。值得注意的是，iCAF 是 CXCL12 的主要来源，这与通过 CXCL12/CXCR4 相互作用积累 TAM 有关14。值得注意的是，CXCL12 与 TCGA BLCA 队列中的 TAM 特征呈正相关。较高水平的 CXCL12 与不良预后显著相关。免疫荧光染色证实 CXCL12 在 BC 组织中由 iCAFs 表达（图 D）。3G-J）。
通过 SCENIC 分析，我们在两个 CAF 亚组中确定了基本基序。MEF2D 和 MEF2C 是 mCAF 特异性基序，在肌肉谱系的转录调控中具有深远的作用15。TCF21 和 TWIST2 基序在 iCAF 中高度激活（图 D）。4a、b）。在之前的一项研究中，发现 TCF21 与冠心病有关，增强了平滑肌细胞的“纤维肌细胞”表型16。TWIST2 是上皮机制转换 （EMT） 的驱动因子。然而，他们在 CAF 中的角色仍然未知。
iCAFs 在 BC 中具有促增殖作用
通过 GO 富集预测 iCAFs 具有生长因子活性。为了证实这一假设，我们分析了 BC TME 中 VEGF、FGF 和 IGF 家族的表达水平（图 D）。值得注意的是，iCAFs 是各种生长因子的主要来源。在这些生长因子中，IGF1（一种 iCAF 特异性组因子）与较差的总生存率有关（图 D）。4d， e）。
为了验证其促增殖作用，我们通过流式细胞术对 iCAFs 进行分选，并在体外将它们与膀胱尿路上皮癌细胞系共培养。值得注意的是，共培养组显示出更高的增殖能力，这证实了iCAFs 在 BC 中的促肿瘤作用（图 D）。4f， g） 的 4 个。-
将 scRNA-seq 与公共数据集相关联
为了研究本研究中鉴定的细胞类型的临床作用，我们使用CIBERSORTx17 评估了 TCGA BLCA 队列样本中每种细胞类型的比例（补充图17）。7A–C，参见“方法”）。引人注目的是，只有 iCAFs 和 mCAFs 的积累与较差的总生存期 （OS） 相关（图 D）。5a、b）。当将细胞组分数据与临床信息相关联时，我们注意到先前研究中描述的分子亚型的细胞类型丰度发生了很大变化4（图 4）。5c、d）。肿瘤纯度最高的管腔状预后最好，而其他 4 组的 OS 无显著差异。基底鳞状细胞的肿瘤纯度最低，因为我们工作中鉴定的几乎所有细胞类型都发生在该组中。值得注意的是，该组 T 细胞也富集，表明抗免疫检查点疗法可能适用于这些患者。与其他细胞类型相比，mCAFs 和 iCAFs 富集在四组中，但管腔组除外。由于管腔-状组主要包含早期样本，这些结果表明 CAFs 与 BC 的肿瘤进展密切相关。此外，我们注意到成纤维细胞标志物在肿瘤组织中显著下调，而上皮标志物上调。这可以解释为什么下调的 DEGs 在细胞外区域富集18。由于正常膀胱粘膜主要含有内皮祖细胞，而成纤维细胞主要位于基质组织中，这种现象可能是采样深度的结果。这可能会掩盖正常上皮细胞和肿瘤细胞之间真实 DEG 的识别（补充图 D）。7D， E）。
图 5：BC 的分子亚型是由 TME 的异质性引起的。
随后，我们扩大了临床队列，从 GEO 和 ArrayExpress 数据库中收集了 3000 多个微阵列分析的 BC 和非恶性粘膜样本（参见“方法”）。用 Combat 函数消除可能的批量效应，然后通过 ConsensusClusterPlus19 将 2959 个肿瘤样本分为五大组（补充图 D）。8A-C）。四个主要簇显示出与管腔-状、腔、管腔浸润和基底-鳞状簇相似的特征。另一个簇与 TCGA BLCA 中的神经组不同，同时表现出管腔鳞状和管腔特征，因此被命名为管腔转换。如图 1 所示。5e-h，该 meta 队列中的 OS 与 TCGA 高度对应，证明了 CAFs 在 BC 进展中的重要作用。iCAF 和 mCAF 具有许多相似的特征，这可能会使 CIBERSORTx 的结果不足。在 TCGA 的队列中，iCAF 特异性标志物 PDGFRA 与 BC 患者的不良 OS 显著相关，而 mCAF 标志物 RGS5 则不然，表明 iCAF 可能比 mCAF 具有更重要的作用（补充图 1）。7F）。 -
为 BC 构建基于 iCAF 的监管网络
使用CellphoneDB2，我们研究了我们目前工作中确定的细胞类型之间的细胞间相互作用网络。值得注意的是，iCAF 与其他细胞类型的相互作用最多，并且它们与 EC 的相互作用特别强烈（图 D）。考虑到 GO 分析和 GSEA 的结果以及我们数据中的表达丰度，我们收集了有关交互对的数据，包括生长因子、CCL 和 CXCL 家族（补充图 D）。9A）。
图 6：BC TME 中的细胞间通讯网络。
iCAF 表达更高水平的 CXCL12，其受体包括 DPP4、CXCR3、CXCR4 和 ACKR3 （CXCR7）。由于 CXCR4 和 CXCR3 在免疫细胞上广泛表达，因此 iCAFs 分泌 CXCL12 是导致 BC 免疫浸润状态的原因。iCAFs 分泌的 CCL2 和 CXCL1 可以与 ACKR1 相互作用，后者在 ECs 表面高度表达。这些细胞因子之前曾报道与 BC21,22 的转移有关，我们将它们的起源确定为 iCAFs（图6b， d）。
iCAFs 产生 VEGF，包括 VEGFA 和 VEGFB，它们与 ECs 上的 VEGF 受体 （FLT1 、 KDR 、 MET 和 FLT4） 结合以促进血管生成。此外，FGFR1 在 iCAFs 和 ECs 上表达，而 FGFR3 在肿瘤细胞上表达。这些受体可以与 FGF 结合，包括源自 iCAFs 的 FGF2 和 FGF7，并显示出促增殖作用。IGF1R 是 IGF1 的一种受体，在肿瘤细胞和基质细胞上表达，这表明 iCAF 也可能是导致对顺铂耐药的因素23。值得注意的是，肿瘤细胞表达高水平的 VEGFA，它具有最强的促血管生成能力。此外，高级别肿瘤细胞高度表达 IGF2，与 iCAFs 上的 IGF2R 相互作用，并促进肿瘤进展24 （图 D）。6c， e）。总之，我们的结果预测iCAFs 可以促进肿瘤细胞和基质细胞的增殖，并有可能能够将免疫细胞募集到肿瘤阶段。
