Nanopore sequencing，纳米孔测序技术，作为新一代高通量测序技术中的佼佼者，不仅仅在读长方面有突出的表现，其在DNA/RNA修饰位点鉴定上也表现不俗。纳米孔测序的基本原理是：蛋白质纳米孔通道被镶嵌在一个绝缘的聚合物膜上，纳米孔通道的孔径可以被需要检测的分子阻塞，通道的两端设有电极可以检测纳米孔局部的电流强弱。测序过程需要在电泳状态下进行，在没有分子通过纳米孔的情况下，电极可以检测到恒定的电流，当DNA分子单链在电泳的作用下通过纳米孔时，因为不同碱基的大小和电子云形态不一致，4种碱基会在不同程度上阻塞纳米通道，进而使局部电流产生不同的变化。通过分析这些变化的特征，在每一个碱基通过纳米孔的过程中，测序仪可以快速读出碱基的类型。而带修饰的DNA/RNA碱基正是由于表现与非修饰碱基的不一样，可以通过这些“错误”的特征数据进行修饰状态的判读，也正因为如此，使用Nanopore sequencing进行修饰测序依赖与优化的base-calling和相应算法。今天分享的这项研究就是使用Nanopore sequencing进行RNA 假尿嘧啶修饰测序。
三言两语
（1）利用Nanopore sequencing，在mRNA、ncRNA和rRNA中检测到了已知的假尿嘧啶修饰位点（Ψ位点），同时也鉴定了一些新的位点。
（2）Nanopore sequencing中U-C的突变是ψ位点鉴定的一个关键“错误”信号；但仅仅依靠这种U-C的mismatch并不能很好的鉴定ψ位点；为此研究者又结合dwell time，trace等特征进行评估，开发了用于修饰位点预测的算法nanoRMS。利用nanoRMS，在酵母线粒体rRNA中鉴定了一个Pus4催化的ψ位点。此外，研究者还将ψ修饰位点鉴定经典方法CMC处理与Nanopore sequencing结合，开发依靠停顿判读ψ修饰位点的nanoCMC-seq，使用该方法可以证明酵母线粒体中Pus4催化的ψ修饰位点。
（3）为了探索假尿嘧啶修饰的动力学，研究人员用氧化、冷和热应激等处理酵母细胞，发现rRNA上的修饰并没有显著的变化，这与早期的报道不一致；但在snRNA，snoRNA上的修饰水平则的确与应激反应相关。
（4）利用nanoRMS同样可以鉴定到mRNA上的ψ修饰位点，不过鉴定到的位点与早前基于CMC处理的NGS结果有比较大的差异，推测可能是由于假阳性，假阴性以及培养条件差异造成的。
Reference
Begik, O. et al. Quantitative profiling of pseudouridylation dynamics in native RNAs with nanopore sequencing. Nat Biotechnol (2021).
