本文亮点：作者团队证明了IL7增加T细胞中的翻译作用，从而提高了传递的mRNA的蛋白质表达。作者团队使用与CD5抗体（tLNP）结合的LNP携带mRNA，转染T细胞以表达报告蛋白mCherry，并研究了在tLNP处理后提高蛋白质表达的方法。在tLNP暴露之前与IL7共培养T细胞，可以增加体外T细胞中mCherry的表达。在体内，用系统性IL7预处理小鼠，然后注射tLNP，可以增加脾脏和淋巴结中mCherry+ T细胞的数量。RNA测序显示，在与IL7共培养时，CD8细胞中与翻译相关的途径得到上调。这些结果指出了增强tLNP介导的体内T细胞工程的独特方法。
摘要：脂质纳米颗粒（LNP）用于包裹和传递mRNA，已成为一项重要的治疗进展。除了疫苗外，LNP-mRNA还可用于许多其他应用。例如，通过使用抗CD5抗体（CD5/tLNP）靶向LNP，可以有效地将mRNA载体传递给T细胞以表达蛋白质。由于静脉注射CD5/tLNP后诱导的蛋白质表达T细胞百分比相对较低（4-20％），作者团队的目标是找到提高mRNA诱导的翻译效率的方法。作者团队展示了使用抗CD3抗体激活T细胞后，可以提高CD5/tLNP转染体外的蛋白质表达，但体内效果不明显。细胞因子可以增加T细胞的健康和激活状态，因此，使用mCherry mRNA作为报告基因，作者团队发现在体外培养的小鼠或人类T细胞中，添加细胞因子IL7显著提高了CD4+和CD8+T细胞传递的mRNA的蛋白质表达。通过先用系统性IL7处理小鼠，随后施用tLNP，作者团队观察到体内T细胞的mCherry蛋白表达显著增加。对体外用IL7处理的小鼠T细胞进行转录组分析，揭示了与蛋白质翻译相关的基因组途径得到增强。在存在IL7的条件下培养的T细胞中，通过电穿孔传递mCherry mRNA后表达的蛋白质水平增加，证明了翻译能力的提高，但在IL2或IL15存在下则未观察到此效应。这些数据表明，IL7选择性地增加T细胞中的蛋白质翻译，这一特性可用于提高体内tLNP传递的mRNA的表达。
Result1：使用抗CD3抗体激活T细胞可提高体外tLNP诱导的mCherry表达率，但在体内效果不明显。
图1：使用抗CD3抗体激活T细胞可提高体外tLNP诱导的mCherry表达率，但在体内效果不明显。 (A) 体外T细胞激活的实验设计。从C57BL/6小鼠的脾脏中磁性分离T细胞，用αCD3/CD28珠激活，并补充IL2。48小时后移除珠，向每百万细胞添加1微克tLNP，24小时后进行流式细胞术。 (B) 非激活（培养基）和激活的T细胞处理mCherry tLNP后的代表性流式细胞图。 (C) 体内实验的实验设计。小鼠静脉注射了10微克的IgG或抗CD5靶向的LNP，24小时后收集脾脏和淋巴结。 (D和E) 脾脏中mCherry+CD4+（D）或CD8+（E）T细胞的百分比。 (F和G) 淋巴结中mCherry+CD4+（F）或CD8+（G）T细胞的百分比。 (H) 实验设计。分离的T细胞与1微克/毫升αCD3或αCD3/CD28珠共培养48小时。向每百万细胞添加1微克CD5/mCherry tLNP，再培养24小时后进行流式细胞术。 (I和J) mCherry+CD4+（I）或CD8+（J）T细胞的百分比。 (K) 实验设计。分离的T细胞与或不带10微克/毫升αCD3 2C11FOS共培养48小时，同时使用珠激活的T细胞作为阳性对照。向每百万细胞添加1微克CD5-mCherry tLNP，再培养24小时后进行流式细胞术。 (L和M) tLNP转染后mCherry+CD4+（L）或CD8+（M）T细胞的百分比。
Result2：IL7在体外和体内增强CD5/mCherry tLNP诱导的蛋白质表达。 (A) 体外细胞因子处理的实验设计。
图2：IL7在体外和体内增强CD5/mCherry tLNP诱导的蛋白质表达。 (A) 体外细胞因子处理的实验设计。分离T细胞并用IL2、IL7或IL15进行培养。每天更换细胞因子，第二天添加tLNP。 (B和C) 在IL2、IL7或IL15存在下，体外mCherry+CD4+（B）和CD8+（C）T细胞的比例。培养基处理和激活的T细胞作为对照。 (D) 体内实验的实验设计。C57BL/6小鼠每天腹腔注射5微克重组小鼠IL7，连续3天。第三天，小鼠静脉注射10微克CD5-mCherry tLNP。tLNP治疗24小时后，收集脾脏和淋巴结进行流式细胞术。 (E和F) 脾脏中表达mCherry的CD4+（E）和CD8+（F）T细胞的总数。 (G和H) 淋巴结中表达mCherry的CD4+（G）和CD8+（H）T细胞的总数。 (I和J) 脾脏中mCherry+CD4+（I）和CD8+（J）T细胞的中位荧光强度（MFI）。 (K和L) 淋巴结中mCherry+CD4+（K）和CD8+（L）T细胞的MFI。
Result3：IL7在T细胞中增加与蛋白质翻译相关基因的特定变化，并支持mRNA电穿孔后蛋白质产量的增加。
图3：IL7在T细胞中增加与蛋白质翻译相关基因的特定变化，并支持mRNA电穿孔后蛋白质产量的增加。 (A) 实验设计。从C57BL/6小鼠的脾脏中分离CD8+T细胞，并仅用T细胞培养基或补充IL2、IL7或IL15进行培养。48小时后，收集T细胞并进行整体RNA测序。 (B) 细胞因子处理的T细胞的PCA分析。计数经VST标准化。 (C) 展示IL7与IL15处理的CD8 T细胞之间差异表达基因的火山图。正的log2倍数变化表示IL7处理与IL15相比上调的基因，而负的log2倍数变化表示IL15处理与IL7相比上调的基因。 (D-F) 使用差异表达基因列表和Hallmarks (D)、Reactome (E) 或基因本体生物过程（GOBP）(F) 数据库进行基因集富集分析。从GOBP分析中展示了与翻译和代谢相关的基因集。点的大小表示FDR（-log10Padj），正的NES表示IL7处理的细胞中的富集，而负的NES表示IL15处理的细胞中的富集。 (G) 电穿孔实验的实验设计。从C57BL/6小鼠的脾脏中分离T细胞，并使用CD3/CD28珠激活或在T细胞培养基中补充IL2、IL7或IL15进行培养。48小时后，T细胞用每百万细胞2微克的mCherry mRNA电穿孔。24小时后测量mCherry表达。 (H和I) 用mCherry mRNA电穿孔后，mCherry+CD4+(H)或CD8+(I) T细胞的比例。
Result4：IL7预处理的人类T细胞可提高CD5-mCherry tLNP在体外诱导的蛋白质表达率。
图4：IL7预处理的人类T细胞可提高CD5-mCherry tLNP在体外诱导的蛋白质表达率。 (A) tLNP转染的实验设计。从PBMC中分离的人类T细胞，要么使用抗CD3/CD28珠激活并补充IL2，要么在T细胞培养基中补充IL2、IL7或IL15，并在48小时后重新补充。72小时后，T细胞被转染，每2 × 10^5细胞使用0.6微克的CD5-LNP-mCherry。24小时后测量mCherry表达。 (B) 休息（培养基）和IL7培养的T细胞，经CD5-LNP mCherry转染后的代表性流式细胞图。数据来自两个供体的三次实验。 (C和D) mCherry mRNA转染后，mCherry+CD4+(B)或CD8+(C) T细胞的比例。
讨论：
tLNP包裹mRNA是一项相对较新的技术，因此对优化它们提高mRNA货物蛋白质表达能力的方法的研究还很有限，特别是在体内。已有的研究将tLNP注射到小鼠体内，显示了T细胞中蛋白质表达水平的不同，当靶向CD3时为4到8％，而靶向CD4或CD5时可达到20％。类似地，作者团队发现使用CD5/tLNP后脾脏中的mCherry表达范围为5到15％。重塑细胞所需达到的蛋白质表达阈值/水平，以实现治疗效果在临床前和临床环境中尚不清楚，因为可能需要达到的治疗效果标准可能会有很大差异。因此，确定提高有效载荷蛋白表达水平的方法可能对于tLNP驱动的原位细胞工程的有效性和成功至关重要，特别是在具有高治疗效果标准的应用中。
作者团队发现，在体外使用固定在培养皿上的抗CD3抗体进行T细胞受体（TCR）刺激，无论是否有CD28共刺激存在，都会增加由CD5/LNP-mCherry引起的蛋白质表达水平。因此，作者团队对这是否可以应用于体内环境感兴趣。由于系统性给予完整抗CD3抗体（如OKT3）会因增加T细胞增殖和炎症细胞因子的释放而导致患者出现严重副作用，作者团队改为使用Fc部分被修饰的抗体。这些抗体对抗原呈递细胞上的Fc受体（FcR）的结合亲和力降低。这减少了交叉连接，降低了通过T细胞上的CD3/TCR复合体的T细胞激活强度，从而减少细胞因子释放和副作用。因此，作者团队研究了非FcR结合抗体2C11FOS，这是teplizumab的小鼠等效物，teplizumab最近已被批准用于糖尿病治疗。作者团队假设使用非FcR结合的抗CD3部分激活T细胞，会通过TCR引起部分刺激，并在不产生不良副作用的情况下增加tLNP蛋白表达。然而，与体外结果相反，CD5/mCherry tLNP给药前用2C11FOS预处理意外地导致表达mCherry的T细胞比例降低。
虽然这一发现非常有趣，但鉴于这种缺乏效应，作者团队没有进行额外研究，因此只能基于文献进行推测。体外和体内观察到的差异之一与抗体交叉连接的程度有关。图1中展示的体外抗CD3数据使用的是固定在板上的抗CD3抗体。将抗体结合到板上增强了交叉连接，并在比添加可溶性抗体时更大程度上激活T细胞，从而触发TCR信号传导及伴随的多种变化，例如增加翻译。而2C11FOS抗体（Fc活性受损）的给药在很大程度上阻止了体内的交叉连接。据认为具有免疫抑制作用的改性非交叉连接抗CD3抗体，通过内吞TCR、部分激活TCR通路导致无应答和耗竭，最终减少T细胞数量来发挥其效果。这些事件似乎并不急性激活翻译途径。为了在体内增加T细胞中的蛋白质翻译，可能需要CD3和CD28的共同刺激。然而，由于与治疗相关的严重副作用，临床上使用抗CD28抗体是不可行的，而作者团队的研究也没有探索这种组合。
因此，作者团队探索了另一种可能在临床上可转化的方法来“激活”T细胞，使用三种常见的γ链细胞因子。IL2能刺激T细胞的增殖、激活和效应功能，同时促进记忆T细胞的存活和分化。IL7对胸腺中T细胞的发育、T细胞的成熟和分化至关重要，促进外周T细胞的存活，维持T细胞的稳态，并且可以增强CD4+和CD8+T细胞的T细胞产生。IL15有类似的效果，促进T细胞的存活和增殖，发育记忆T细胞，并增强T细胞的细胞因子产生以及指导CD8+T细胞的细胞毒性活动。有趣的是，作者团队的实验表明，IL7比IL2、IL15以及所有其他常见的γ链细胞因子，以及IL6、IL27、IL33和TNFα（在人类T细胞中）更有效，能在体内给小鼠tLNP治疗后以及体外分离的小鼠和人类T细胞中增加蛋白质表达水平。
在临床上，重复剂量的IL7已被证明耐受性良好，并且能够引起T细胞扩增，毒性小。CYT107，一种糖基化的重组IL7，已被广泛使用，并具有类似的免疫学效果。由于IL7能够扩展CD4+和CD8+T细胞，因此这对于在临床环境中将IL7与tLNP结合使用增加了额外的好处，它不仅可以增强蛋白质表达，还可以增加总的T细胞数量，其中一些会被mRNA有效载荷转染。因此，在tLNP注射之前使用短期IL7预处理可能是一种可转化且有用的方法。这是与外周血液工程化CAR T细胞广泛使用的淋巴细胞耗竭预处理相比的一个范式转变，呈现出几个优势，包括避免造血毒性和保留或可能共同利用完整的内源性免疫系统。
为了实现有效的tLNP介导的转染，靶向抗体的颗粒必须与感兴趣细胞表面的同源配体结合，被内吞，处理，然后释放mRNA有效载荷到细胞质中，在那里它被翻译成功能性蛋白质。为了探索这种IL7选择性效应的可能机制，作者团队进行了转录组研究，比较了在仅用培养基或补充了IL2、IL7或IL-15的培养基中培养的静息细胞的基因变化。作者团队主要关注IL7与IL15处理细胞之间的比较，因为这些条件下细胞的活性远高于用IL2处理或仅在培养基中培养的细胞。然而，作者团队也将IL7与IL2进行了比较，结果与IL7与IL15的比较一致。作者团队的数据非常引人注目，显示IL7处理的T细胞在与MYC相关的通路以及大量核糖体和翻译相关基因集中富集，而在IL15处理的细胞中，与先天免疫系统、干扰素反应和G蛋白偶联受体信号传导相关的通路得到富集。通过在mRNA电穿孔前用IL7培养T细胞，从而在蛋白质翻译方面显示功能性变化，这种培养方式导致所表达的mRNA编码的蛋白质增加，此处为mCherry，与IL2、IL15或在无细胞因子的情况下仅用培养基培养的T细胞相比。因此，这些数据表明，IL7增加tLNP诱导的蛋白质表达的主要机制可能是增强T细胞中所给予mRNA的翻译。作者团队没有详细探索其他机制，然而，在IL7处理后，作者团队并未观察到CD5表达的差异（这可能会增加tLNP靶标的可用性），也没有富集与内吞作用相关的基因。
TCR刺激和通过抗CD3/CD28抗体激活T细胞对mRNA产生和翻译的影响已经有报道。TCR的刺激导致蛋白质产生增加30至100倍，活跃产生蛋白质的T细胞数量增加了1000倍。激活T细胞导致tRNA写入蛋白的增加，从而增强了翻译效率。这进而导致关键功能蛋白质的快速和增强的翻译和合成，以促进T细胞扩增和增殖，其中一个重要的例子是MYC（作者团队也观察到IL7上调的蛋白）。在电穿孔后，抗CD3/CD28激活的T细胞中mCherry mRNA的蛋白质翻译显著增加与这些发现非常一致，表明激活的T细胞在tLNP治疗后蛋白质表达的增加部分与翻译能力的增加有关。作者团队的数据表明，IL7具有类似的效应。
据作者团队所知，IL7增强T细胞中蛋白质翻译的能力尚未报告，尽管最近的一篇论文提供了一些间接证据，显示当T细胞未受抗原刺激时，单体相关的核糖体蛋白mRNA的数量与CD127（IL7受体）的表达呈正相关。然而，有报道称，将人类T细胞培养在IL7中会增加细胞对慢病毒和HIV衍生载体的转导，与未处理的细胞相比。鉴于作者团队的发现，尝试确定这些效应是否至少部分归因于增加的mRNA翻译而不是增加的增殖或其他与病毒相关的机制将是很有趣的。
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尽管这项研究表明IL7可以增加对一个已被描述的标记mRNA mCherry的tLNP诱导表达，但将这些发现扩展到实际的治疗载体，如CAR、细胞因子或双特异性抗体，将会很有意义。事实上，作者团队实验室的初步数据表明，IL7能够增加作者团队在心脏纤维化中显示具有体内疗效的靶向成纤维细胞激活蛋白CAR的表达水平（手稿正在准备中）。总之，作者团队展示了临床可用的细胞因子IL7可以在体外和体内改善tLNP输送的mRNA的蛋白质表达。重要的是，作者团队表明IL7增加了T细胞的翻译能力是这一发现背后的一个机制。因此，作者团队建议这一特性可以用于在tLNP给药后体内提高输送的mRNA的翻译。
