免疫微环境的异质性是肿瘤耐药、复发和预后差的重要原因之一[1-3]。近年来，免疫治疗及联合治疗给晚期肿瘤患者带来希望，系统探究肿瘤免疫微环境的异质性对于治疗选择、疗效预测、方案优化及开发新的免疫治疗靶点等有重要指导作用。然而，研究人员对肝癌免疫微环境的异质性仍缺乏系统深入的认知。以往研究主要基于病理分析或Bulk转录组测序，其结果无法准确解析其细胞组成且容易忽略含量较少的关键细胞亚群。单细胞测序技术的发展促进了肿瘤免疫领域的探索，目前多项研究已对肝癌进行了单细胞水平的探究[4-6]。然而，这些研究大多关注特定类型细胞，其结果无法反映免疫微环境的全部特征。因此，亟需无偏差的、包含所有细胞亚型的研究策略以系统揭示肝癌免疫微环境的异质性。

2022年11月9日，北京大学第一医院肿瘤转化研究中心张宁团队与北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民团队、北京大学人民医院肝胆外科朱继业团队紧密合作，在Nature发表了题为Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity的研究论文，揭示了肝癌免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性。

作者介绍：

张宁教授，2001年在约翰霍普金斯大学医学院获得博士学位，在美国国立癌症研究所接受CRTA博士后训练，现任北京大学医学部教授，国家杰出青年科学基金获得者，入选国家万人计划、科技部中青年科技创新领军人才等，兼任中国抗癌协会常务理事、副秘书长、中国抗癌协会期刊出版专业委员会主任委员。张宁教授长期从事生物医学及细胞生物学研究，围绕肝癌这一关键临床难题，从机理研究、生物标志物鉴定、药物筛选、纳米技术等多个侧面入手展开转化应用研究，取得了一系列科研成果。

张宁教授

张泽民教授，1988年在南开大学获得遗传学学士学位，1995年于美国宾州州立大学获得生物化学与分子生物学博士学位。此外他还在加州大学伯克利分校获得了IT技术的训练，在加州大学旧金山分校的医学实验室完成了博士后训练。1998年-2014年在生物医药公司基因泰克/罗氏（Genentech/Roche）工作，担任癌症基因组学和生物信息学组的首席，致力于应用机器学习和高通量测序等高新技术进行抗癌药靶和生物标记物的发现。于2014年加入北京大学，现任北京大学生命科学学院讲席教授，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）与未来基因诊断高精尖创新中心研究员，北大-清华生命联合中心高级研究员。

张泽民教授致力于用前沿的基因组学和生物信息学技术来解决癌症生物学中的重要问题，利用计算和实验相结合方法来揭示肿瘤发生过程、肿瘤微环境和对药物响应中的系统变化和重要遗传因素，以推进癌症免疫治疗和靶向治疗的发展。主要的研究方向包括：（1）应用单细胞测序技术来研究肿瘤微环境特别是肿瘤浸润免疫细胞的精确组成、相互作用以及功能状态；（2）研究肿瘤的异质性、基因组机制及其对耐药性的影响；（3）开发原创的生物信息学工具和数据库，来进行单细胞基因组数据和癌症基因组大数据的整合、分析和可视化，以揭示癌症的亚型、驱动基因以及其他致癌因素的遗传基础，从而发现新型癌症靶点和标记物。

张泽民教授

研究内容：

1. 一个大规模的肝癌单细胞图谱

研究人员收集124个原发性肝癌病例的160个样本和8只小鼠的29个新鲜组织样本，完成了共189个样本的无抗体富集的单细胞转录组测序（图1a，b）。一共检测到1,092,172个细胞，鉴定了肝癌免疫微环境的89个细胞亚群（图1c）。

Fig. 1 | The single-cell landscape of 124 patients with liver cancer.

2. 细胞模组分析揭示肝癌的五种免疫微环境亚型

为了研究原发性肝癌（PLC）的肿瘤免疫微环境（TIME）亚型，作者检查了来自肿瘤组织的细胞的共富集模式。层次聚类确定了五个稳定的细胞模块（CM1-CM5）（图2a）。根据CM1-CM5的不同富集程度，作者将患者分层为五个相应的TIME亚型（图2b-e），这些亚型的性质分别考虑了4个方面:(1)细胞簇，(2)功能标记基因表达，(3)TIME相关基因特征和(4)预后相关性。

CM1含有活化的髓系细胞和T细胞群，包括富含免疫调节分子的成熟树突状细胞(DC_03_LAMP3)、CXCL9+巨噬细胞(Mph_06_CXCL9)、辅助性Th1细胞（CD4T_07_CXCL13）和耗竭T细胞（图1c）。IFNG、GZMB和PDCD1的高表达，以及富集"共激活分子 "和"检查点分子 "的特征，表明 CM1为主的患者表现出免疫激活状态，因此被命名为免疫激活型（TIME-IA）。Mph_03_SPP127的富集和IL1B的高表达——两者都与“髓系细胞免疫抑制”和“促肿瘤细胞因子”的免疫抑制富集特征相关，并与较差的预后相关，共同提示CM2具有免疫抑制和促肿瘤表型，因此相应的患者被指定为髓系富集免疫抑制型(TIME-ISM)。

基质细胞在CM3和CM4中都得到了富集。两个基质簇（EC_03_TFF3和Fb_01_FAP）的富集，肿瘤激活相关的基质基因如COL1A1、MMP11和ITGA1的高表达，"基质"和"肿瘤相关成纤维细胞"的富集特征以及与较差预后的关联，将以CM3为主的患者定为基质富集免疫抑制型（TIME-ISS）。相比之下，CM4包含大多数内皮细胞和间充质细胞集群，但缺乏免疫细胞。特别是丰富的CXCL12+成纤维细胞（Fb_02_CXCL12）可以将T细胞从肿瘤细胞中排除（图2f）。在这些结果的基础上，作者提出了免疫排斥表型（TIME-IE）。CM5包含肝脏驻留细胞群，包括肝脏驻留自然杀伤细胞（NK_05_CD160）,Kupffer细胞（Mph_01_MARCO）和肝窦内皮细胞（EC_01_CLEC4A），并与更好的预后有关。因此，以CM5为主的患者被指定为免疫驻留型（TIME-IR）。随后，作者将这个分类系统命名为TIMELASER，即"单细胞分辨率下的肿瘤免疫微环境亚型，包括免疫激活、抑制、排斥和驻留表型"（图2d）。

通过细胞相互作用分析发现每种亚型均存在不同的趋化因子受体-配体网络，提示了不同亚型的形成机制（图2g，h）。在TIME-IA和TIME-ISM亚型中观察到肿瘤细胞和TIME细胞的趋化因子表达模式一致，这表明正反馈回路。例如，CXCL9/10/11-CXCR3配受体对在TIME-IA中富集，而CXCL1/3/8-CXCR2配受体对在TIME-ISM中增强（图2g, h）。这些结果以及其他TIME亚型中独特的配受体对，表明不同的趋化因子网络有助于TIMELASER亚型的形成。

Fig. 2 | Five TIME subtypes of PLC.

3. 系统揭示11个中性粒细胞亚群、鉴定6群肿瘤相关中性粒细胞并通过实验证明CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN的促肿瘤机制

中性粒细胞是一类非常脆弱的细胞，通常认为其在体内进入外周血后存活不超过一周，体外存活不超过24小时。因此，先前的肝癌单细胞研究均未捕获到这一群细胞[7]。作者发现在TIME-ISM中含有多种中性粒细胞亚群的富集，它们与不良预后的关联以及它们的稀缺性促使作者进一步研究中性粒细胞。共有34307个中性粒细胞被分为11个亚群，这些亚群表现出明显的组织分离和癌症类型偏好（图3a,b）。Neu_02_S100A12、Neu_03_ISG15和Neu_04_TXNIP主要是外周血中性粒细胞（PBNs），而Neu_05_ELL2和Neu_06_PTGS2主要是癌旁中性粒细胞（ALNs），其他六个亚群（Neu_01_MMP8、Neu_07_APOA2、Neu_08_CD74、Neu_09_IFIT1、Neu_10_SPP1和Neu_11_CCL4）都在肿瘤中富集，被指定为TANs。发育轨迹分析显示，从PBNs到ALNs再到TANs有一条清晰的顺序分化路径（图3a）。

随后，研究人员解析了这些中性粒细胞亚群的关键转录因子（图3c）发现PBNs中SPI1的活性较高，而NFE2L2和CREM在ALNs和TANs中都比较活跃。MAFG、BHLHE40和HES4在TANs中更活跃，可能与肿瘤中中性粒细胞的重编程有关。

作者接下来关注两个TAN亚群：Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1的表型和功能。CCL4+ TANs（Neu_11_CCL4）表达了高水平的趋化因子基因CCL3和CCL4(图3d）。体外诱导的TANs也显示CCL4表达升高（图3e）。作者接下来通过对患者来源的TANs和非肿瘤性中性粒细胞的体外分析(即PBNs或ALNs，被称为非TANs）直接研究了趋化因子的分泌。与非TANs相比，TANs显示出更高的CCL4可及性信号和CCL4蛋白的分泌（图3f,g）。CCL4+ TANs被预测为通过CCL4-TANs招募巨噬细胞（扩展数据图8i）。一致的是，当与TANs共培养时，在趋化实验中招募了更多的自体单核细胞（图3h）。这些结果验证了CCL4+ TAN通过招募肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤生长。

作者发现，与非TANs相比，TANs的CD274（编码PD-L1）表达明显增加，其中Neu_09_IFIT1的表达最高（图3i）。体外诱导的TANs的CD274表达以时间依赖的方式持续增加（图3j）。荧光激活细胞分选（FACS）分析进一步显示，与对照组相比，体外诱导的TANs中PD-L1的表达明显更高（图3k）。ATAC-seq和FACS分析也显示，在患者衍生的TANs中，CD274和PD-L1表达的可及性信号更高（图3l，m）。为了研究TANs的PD-L1高表达是否会直接抑制T细胞活性，研究人员将CD8+T细胞与体外诱导的TANs或患者来源的TANs共同培养。与体外诱导的TANs共培养的CD8+ T细胞显示T细胞毒性标志物IFNγ和活化标志物CD25和CD69蛋白水平较低（图3n）。加入抗PD-L1抗体后，与对照组相比，PBN-MHCC97H组CD8+ T细胞中IFNγ的下降被逆转(图3o)，证实PD-L1介导了TANs的抑制功能。此外，与人TANs共培养的自体CD8+ T细胞表现出较低的增殖性能(CFSE)，以及较低的IFNγ、GZMB、PRF1和CD25水平（图3p）。此外，mIHC揭示了PD-L1+中性粒细胞和PD1+ CD8+ T细胞的物理接近性(图3q)，支持它们的直接相互作用。这些结果共同证明了PD-L1+ TAN通过抑制CD8+ T细胞的杀伤功能促进肿瘤生长。

Fig. 3 | Neutrophil heterogeneity and functional validation in humans.

4. 构建小鼠肝癌模型、揭示其中性粒细胞亚群与人高度保守并证实去除中性粒细胞可以延缓肿瘤生长

为了进一步在体内探索中性粒细胞的促肿瘤机制，研究人员基于Alb-cre/Trp53fl/fl肝脏特异敲除小鼠和肝癌驱动突变构建两种小鼠肝癌自发肿瘤模型（Myc-∆90Ctnnb1, pTMC；Myc-KrasG12D, pTMK），并对其进行单细胞测序分析。最终共有17,780个中性粒细胞被分为12个集群，显示出明显的组织特异性和有序的发展轨迹（图4a,b）。中性粒细胞亚群的无偏见跨物种数据整合和关键特征基因的一致表达表明，小鼠和人类的中性粒细胞基本上是保守的（图4c）。具体来说，来自TIME-ISM的三个TAN亚群 TIME-ISM（Neu_09/10/11）分别对应于mNeu_10/11/12。并且在小鼠TANs中观察到较高的Cd274表达，与人类TANs的表达一致（图4d）。这些结果为在小鼠模型中研究基于中性粒细胞的治疗奠定了基础。

TIME-ISM TANs（Neu_09/10/11）的共同的促肿瘤表型促使作者研究在体内消除这些促肿瘤TAN亚群的治疗效果。由于没有专门针对Neu_09/10/11的组合式体内消除策略，作者推断，使用抗ly6g抗体消耗中性粒细胞[8]可能是模拟这种治疗的最直接方法。中性粒细胞耗竭导致肝癌结节和肿瘤重量明显减少（图4e,f）。

与同型对照相比，抗Ly6G治疗后，TANs的数量和TANs的PD-L1表达都有所下降（图4g）。IHC分析证实，Ly6G阻断组的中性粒细胞和增殖性恶性细胞数量较少（图4h）。细胞内Ly6G的分析证实，约70%的中性粒细胞在Ly6G阻断后被耗尽，与IHC一致（图4h）。尽管Ly6G阻断并没有改变CD8+ T细胞的数量，但检查点标记PD-1和TIM3水平的降低表明它们的衰竭状态得到缓解（图4g）。此外，作者使用荧光素酶报告基因(pTMC- luc)对pTMC小鼠进行了Ly6G阻断治疗。（图4i）。在肿瘤形成后36天(7天)阻断Ly6G显示生物发光信号和肿瘤负荷显著降低（图4j）。总的来说，中性粒细胞的消耗可以减弱巨噬细胞的招募和T细胞的抑制，从而导致肿瘤的抑制。这些结果提示开发基于中性粒细胞的免疫治疗靶点有望形成新的肝癌治疗策略。

Fig. 4 | Neutrophil heterogeneity and depletion in mouse models.

总结

本研究首次在单细胞精度定义了肝癌的五种免疫微环境亚型（TIMELASER），探究了其细胞组成、空间分布、基因组特征和趋化因子受体-配体网络，首次全面揭示肿瘤相关中性粒细胞(TAN)的异质性，发现并验证CCL4+、PD-L1+ TAN两个关键亚群的促肿瘤机制，最终通过构建小鼠肝癌模型, 从In vitro, Ex vivo, In vivo三个层面，逐步深入地证明靶向肿瘤相关中性粒细胞有望形成新的肝癌免疫治疗方案研究成果预示，针对肿瘤相关中性粒细胞的干预，有望大幅增加免疫检查点有效治疗的患者人群。这些成果为肝癌乃至实体瘤的基础研究和临床诊疗提供了关键信息。

参考文献：

1. Binnewies, M. et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat. Med. 24, 541–550 (2018).

2. Thorsson, V. et al. The immune landscape of cancer. Immunity 48, 812–830 (2018).

3. Li, X. et al. The immunological and metabolic landscape in primary and metastatic liver cancer. Nat. Rev. Cancer 21, 541–557 (2021).

4. Xue, Ruidong et al. Variable Intra-Tumor Genomic Heterogeneity of Multiple Lesions in Patients With Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology vol. 150,4 (2016).

5. Xue, Ruidong et al. Genomic and Transcriptomic Profiling of Combined Hepatocellular and Intrahepatic Cholangiocarcinoma Reveals Distinct Molecular Subtypes. Cancer cell vol. 35,6 (2019).

6. Guo, Lin et al. Single-Cell DNA Sequencing Reveals Punctuated and Gradual Clonal Evolution in Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology vol. 162,1 (2022).

7. Ramachandran, Prakash et al. Single-cell technologies in hepatology: new insights into liver biology and disease pathogenesis. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology vol. 17,8 (2020).

8. Boivin, G. et al. Durable and controlled depletion of neutrophils in mice. Nat. Commun. 11,2762 (2020).