Sevoflurane impairs m6A-mediated mRNA translation and leads to fine motor and cognitive deficits
这是2021年4月发表在Cell Biol Toxicol上的关于“七氟烷损害 m6A 介导的 mRNA 翻译并导致精细运动和认知缺陷”的文章。通讯作者是上海交通大学医学院上海市第九人民医院麻醉科的姜虹教授。
研究背景
七氟烷是儿童最常用的麻醉剂之一，可能导致神经元凋亡、突触缺陷、神经炎症、Tau 磷酸化、幼年动物大脑髓鞘形成破坏以及幼年恒河猴和小鼠的认知障碍(Alvarado etal. 2017 ; Li et al. 2019 ; Lu et al. 2017 ; Raper et al. 2017 ; Shen et al. 2013 ; Tao et al. 2014 ; Zhang et al. 2013)。尽管许多研究发现七氟醚麻醉会导致大脑各区域基因表达发生显著变化，但七氟醚麻醉后是否会发生信使RNA 水平的转录后调控尚不清楚。
mRNA 可以进行各种不同的化学修饰，包括 N6 位腺苷的甲基化，这会导致 N6-甲基腺苷 (m6A) 的形成(Wang andHe.2014)。m6A 是成人大脑中最丰富的可逆 mRNA 修饰 (Chang et al. 2017)。m6A 修饰的可逆建立及其生物学功能的执行依赖于一系列称为阅读器、编写器和擦除器的蛋白质。m6A 结合蛋白 YTHDF1 是 m6A 阅读器之一，它直接与 m6A 位点相互作用并促进含有 m6A 的 mRNA 的翻译效率（Shi et al.2017; Wang et al. 2015; Wu et al. 2017）。已发现YTHDF1 在中枢神经系统中执行关键功能，例如调节轴突导向，脊髓连合神经元中 YTHDF1 的特异性消融会导致预交叉轴突导向缺陷（Zhuang et al. 2019）并导致学习缺陷和记忆（Shi et al. 2018）。
主要结果
多次暴露于七氟烷后前额叶皮层YTHDF1 的表达降低
在之前的工作中，作者发现m6A 结合蛋白 YTHDF1 促进了 m6A 甲基化神经元 mRNA 的翻译，并且这一过程有助于学习和记忆(Shi 等人，2018 年)。然而，YTHDF1 在麻醉诱导的神经毒性中的作用尚不清楚，麻醉对 m6A 修饰的影响也有待探索。因此作者对P7、P21 和 P35 幼年恒河猴进行七氟烷麻醉，每次持续 4 小时，模型显示麻醉损害了中枢神经系统的髓鞘形成，并引起焦虑和视觉识别记忆障碍（Alvarado et al. 2017; Zhang et al.2019)。作者在第三次七氟烷麻醉后立即收获了幼年恒河猴的前额叶皮层，发现暴露于七氟烷后YTHDF1 的蛋白质水平降低（图 1A、B、C、D）。作者接下来研究了YTHDF1和其他 m6A 通路调节剂是否受年轻小鼠大脑中七氟烷暴露的调节：每天用3%七氟烷处理 P6 小鼠 2 小时，持续三天（P6、P7 和 P8），并从七氟烷 (SEV) 和对照 (Ctrl) 组收集前额皮质和海马组织，然后进行蛋白质印迹。与之前的结果一致，YTHDF1的蛋白和 mRNA 表达水平在前额叶皮层显著降低，但在海马体中没有显著降低（图1B、C、D）。YTHDF2 是另一种 m6A 阅读器蛋白，在促进神经发育相关 mRNA 靶标的 m6A 依赖性降解中起着关键作用 (Wang et al.2014)，但在多次七氟烷暴露后，YTHDF2 的蛋白质和 mRNA 水平在前额叶皮层或海马体中没有改变（图1B、E、F）。此外，成年小鼠前额皮质中YTHDF1 的蛋白表达水平不受七氟烷的影响（图1G、H）。这些结果表明，七氟烷特异性地导致小鼠大脑皮层中 YTHDF1 蛋白的减少，且这种影响仅限于大脑发育阶段。
七氟烷降低了中间神经元子集中YTHDF1 的表达
前额叶皮层在学习、运动、记忆和决策等高级认知功能中起着重要作用。先前的研究确定了七氟烷麻醉后皮质中失调的基因，但没有解决它们的细胞类型特异性。为了全面研究多次暴露于七氟醚的基因表达谱，作者从暴露或未暴露七氟烷的小鼠中分离出皮质，并进行了单细胞测序，以识别神经系统各种细胞亚群中的基因表达谱。作者分离了给予临床相关浓度为3%七氟烷+60%氧气麻醉的 P6 - P8小鼠的前额叶皮质组织（n= 3）进行了基于10X 基因组学的单细胞测序，给予 60% 氧气的小鼠用作对照组 ( n= 3)。每只小鼠获得了大约5000个转录组，并基于特定基因的强表达将总共 14,917 个细胞分配到各种簇，聚类为 13 个组（图2A）。
中间神经元尽管数量较少，但它们在皮层网络的发育和组织中起着至关重要的作用，这些皮层网络涉及广泛的认知和情感功能（Bartolini et al.2013；Kepecs and Fishell.2014)。 更重要的是，这些 GABAergic 中间神经元通过不同的抑制连接调节数亿个锥体细胞的兴奋性，并参与七氟烷诱导的新生小鼠神经毒性（Ji et al.2017 ）。因此，作者专注于GABA 能神经元中发生的基因表达变化，发现YTHDF1 的表达在暴露于七氟醚后（倍数变化 SEV/Ctrl = 0.88）在中间神经元（GAD1 阳性神经元）中显著下降但程度较小（12%） ,p = 3.69e−05)（图2B）。作者根据中间神经元中表达的各种特异性标记进一步将中间神经元分为8 个亚群（图2C）。有趣的是，YTHDF1 在簇 3 中间神经元中下调 (30%) 更为显著（倍数变化SEV/Ctrl = 0.70，p = 0.019)，它表达了一种特定的中间神经元标记，即 Sp8（图2D)，而YTHDF1 的家族成员 YTHDF2 和 YTHDF3 在中间神经元的所有亚群中保持不变。Sp8 是一种重要的转录因子，在调节中间神经元发育中起着关键作用（Fu et al.2014 ；Li et al.2018 ；Ma et al.2013 ；Wei et al.2019 ）。例如，Sp8 阳性中间神经元后来发展为表达血管活性肠多肽 (VIP) 的中间神经元（Mayer et al.2018 ）。这些结果表明七氟烷暴露导致 YTHDF1 发生特定变化。
为了验证YTHDF1 在发育中的小鼠大脑中的内源性表达，作者在出生后第9 天小鼠的脑切片中使用针对 YTHDF1 和 Sp8 的抗体进行了免疫组织化学实验（图 2E）。发现YTHDF1 和 Sp8 在很大程度上共定位在一起，并且 YTHDF1 的表达确实在 Sp8 阳性中间神经元中减少（图 2E，G）。有趣的是，作者发现YTHDF1 也在 Sp8 阴性神经元中表达，并且在多次七氟烷处理后，YTHDF1 的总信号归一化为细胞核的 DAPI 信号似乎减少（图 2E，F）， 虽然 YTHDF1 在 Sp8 阴性细胞中的表达水平略高于 Sp8 阳性细胞，但七氟烷也导致 Sp8 阴性神经元中 YTHDF1 表达的降低，表明 YTHDF1 可能不仅存在于中间神经元中，还存在于兴奋性神经元中（图2H、I）。
七氟烷在体外抑制YTHDF1依赖性蛋白质合成
YTHDF1的下游基因是在作者之前的研究中使用基于交联和免疫沉淀的测序方法(CLIP-seq)定义的 (Shi et al.2018)。qRT-PCR 表明许多下游基因的表达在七氟烷暴露后降低。突触素是 YTHDF1 下游靶基因之一，也是一种关键的突触前蛋白，被发现在七氟烷暴露后胎儿和出生后小鼠大脑中减少（Xu et al.2017；Zheng et al.2013）。在本研究中，暴露于七氟烷后，幼年恒河猴前额叶皮层的突触素蛋白水平降低（图1A)。从E14.5小鼠制备小鼠皮层神经元培养物，并从 DIV10 天到 DIV12 天每天用七氟烷处理它们，然后进行蛋白质印迹分析，发现七氟烷处理后YTHDF1和突触素的蛋白水平显著降低（图3A-E）。重要的是，七氟烷处理后突触素和YTHDF1 mRNA的稳定性保持不变，表明七氟烷处理导致突触素和YTHDF1的转录后调节。由于培养条件下的大多数小鼠皮层神经元是兴奋性谷氨酸能神经元，作者认为YTHDF1的减少可能不仅限于表达 VIP 的神经元，而且也发生在谷氨酸能神经元中。
YTHDF1的功能是与 m6A 甲基化靶标相互作用并促进含有 m6A 的转录本的翻译，从而促进大脑中的蛋白质合成（Shi et al.2018；Wang et al. 2015）。由于作者发现七氟烷全身麻醉会导致幼小动物皮质中YTHDF1蛋白的下调，因此作者想检查七氟烷暴露是否会降低小鼠皮质神经元中的一般蛋白质合成。发现在七氟烷处理后，培养的小鼠皮层神经元的蛋白质合成显著减少，而通过慢病毒感染重新引入YTHDF1，七氟烷处理诱导的蛋白质合成减少被完全逆转（图3E-H）。这一证据强烈表明，七氟烷通过下调YTHDF1抑制皮质神经元中的蛋白质合成。
研究表明，表观遗传调控，包括DNA甲基化，已被证明在七氟烷暴露后的基因表达调控中发挥关键作用（Zhang et al. 2019）。因此，作者通过在七氟烷处理之前应用5-AZA（一种 DNA 甲基转移酶的一般阻断剂）来检查 DNA 甲基化是否有助于 YTHDF1 和突触素的下调（图 3D ）。有趣的是，作者发现阻断DNA甲基化对七氟烷诱导的 YTHDF1 和突触素下调没有影响（图3H-K），表明DNA甲基化不参与观察到的影响。
突触素mRNA直接受 YTHDF1 和 m6A 甲基化调控
为了探索 YTHDF1 在 SEV 处理后调节小鼠前额皮质基因表达的分子机制，确定 YTHDF1 是否直接调节前额皮质中的关键 mRNA。作者使用突触素作为靶标，并在使用靶向突触素的引物进行定量 PCR 后，使用抗 YTHDF1 抗体进行 RNA 免疫沉淀实验。结果显示，与 IgG 免疫沉淀样品相比，突触素 mRNA 在抗 YTHDF1 抗体免疫沉淀样品中明显富集，表明突触素 mRNA 是皮质神经元中 YTHDF1 的直接靶标（图 4A、B ）。
接下来，作者对用抗 YTHDF1 或抗 m6A 抗体免疫沉淀的 RNA 样本进行了下一代深度测序，以检查年轻小鼠前额叶皮层中是否存在 m6A 修饰。作者发现来自抗 YTHDF1 和抗 m6A 免疫沉淀的富集峰信号重叠超过 50%，与相邻基因位点相比，突触素 mRNA 被 m6A RNA-IP 高度甲基化和富集（图4C-E）。该结果表明突触素 mRNA 可能很容易受到 N6-甲基腺苷修饰变化的影响。
在用来自小鼠前额皮质的抗 m6A 抗体免疫沉淀的 mRNA 中，作者发现 m6A 甲基化主要发生在外显子和基因体上，并且 m6A 相关的 RNA 位点表现出与先前报道的相似的基序（图 4F，G ）。此外，使用基因本体分析，作者发现突触相关基因是小鼠前额叶皮层中受 YTHDF1 和 m6A 甲基化调控的顶级基因簇（图 4H，I）。这一证据表明突触素是 YTHDF1 的关键靶基因，其 mRNA 通过 m6A 依赖机制高度甲基化。
突触素减轻七氟烷诱导的神经突生长缺陷
接下来，作者研究了突触素是否能够减轻由七氟烷引起的神经元发育缺陷。为了分析树突状乔木，在 DIV2 上用突触素质粒和 GFP 质粒转染原代培养的神经元。从 DIV3 到 DIV5 进行了七氟烷处理，并在 DIV8 上进行了树突测试。树突乔木重建的参数测量如下：分支总长度（每个神经元所有分支长度的总和），分支数（每个神经元所有分支的总和）和分支节点数（所有分支的总和）每个神经元的分支点）。结果显示，七氟烷处理的神经元具有更短的分支长度和更少的分支和分支节点（图 5A-F）). 突触素过表达减弱了七氟烷诱导的分支和分支节点数量的减少，而它对分支长度的减少没有影响（图5A-F）。
YTHDF1的恢复减轻了七氟烷引起的精细运动功能缺陷和认知障碍
在验证突触素作为 YTHDF1 和 m6A 的直接靶标后，作者检查了通过 AAV 注射重新引入 YTHDF1 是否恢复了突触素的表达水平。通过在 P0 静脉注射 BBB 交叉 AAV-PHP-EB 载体（该载体含有对照或标记-YTHDF1 cDNA），在 P6-P8随后给与60% 氧气或 3% 七氟烷+60% 氧气处理（Chan et al.2017）（图.6A ）。如使用抗 flag 和抗 YTHDF1 抗体的蛋白质印迹所示（图6B、C、D），作者在小鼠皮层中发现了 flag-YTHDF1 的外源性表达。同时，作者发现多次暴露于七氟烷后突触素的减少被体内外源性 YTHDF1 的递送完全逆转（图6E，F），这表明七氟烷诱导的突触素丢失是 m6A RNA 甲基化依赖性的。这些发现进一步表明，七氟烷暴露会改变 m6A-YTHDF1-下游突触素的表达，并可能导致突触丧失和认知功能障碍。
研究发现，儿童多次接受麻醉会导致青春期后期的精细运动和运动协调能力下降（Walkden et al. 2020 ；Warner et al. 2018 ；Zaccariello et al. 2019 ）。作者检查了在全身麻醉后 6 个月接受七氟烷或异丙酚全身麻醉以进行双侧人工耳蜗置换术的患者（小于 3 岁）的粗大和精细运动技能。结果表明，接受全身麻醉的儿童在手术后 6 个月表现出精细运动技能受损（n = 17、101.02 ± 7.43 和 94.71 ± 8.06，p = 0.004）。有趣的是，接受早期吸入麻醉（用于麻醉维持的七氟烷）的儿童在手术后 6 个月表现出精细运动技能受损（分别为n = 10、101.49 ± 6.90 和 97.35 ± 7.50，p = 0.011）。
因此，作者调查了精细运动技能是否在小鼠模型中发生了改变，以及该过程是否与 m6A 依赖性调节通路有关。作者让小鼠从 P6 到 P8 每天接受七氟烷暴露，并使用横梁行走测试检查 P30 的运动技能（图6G、H、I）。作者发现，在七氟烷暴露 3 天后，运动协调能力（通过木梁行走期间的脚滑次数衡量）受到损害（图6G、H、I）。引人注目的是，在 P0 递送 YTHDF1 完全缓解了运动功能的缺陷（图6G、H、I), 强烈暗示 YTHDF1 在年轻大脑精细运动技能发展中的重要性。作者还使用 Barnes 迷宫来评估小鼠在 P30 到 P34 的学习和记忆功能。最后，作者发现将 YTHDF1 递送到幼鼠的脑组织中可减轻七氟烷麻醉引起的认知障碍（图6J，K）。这些证据表明，YTHDF1 在幼鼠的精细运动技能和认知功能中发挥了关键作用，而这些功能受到七氟烷麻醉的影响。
总之，YTHDF1在多次七氟烷麻醉暴露后，在年轻小鼠的前额皮质中显著下调。全转录组实验表明，小鼠前额叶皮层中与突触功能相关的许多 mRNA 靶标与 m6A 甲基化和 YTHDF1 相关。其中，突触素的m6A甲基化随多次七氟烷暴露而降低，同时，多次麻醉暴露的小鼠精细运动控制技能和认知功能受损，通过血脑屏障(BBB)交叉病毒递送系统重新引入 YTHDF1 可以完全逆转这些影响，表明七氟烷麻醉可能通过影响 m6A 依赖性 mRNA 翻译来影响早期大脑发育进而影响认知和精细运动控制。
