1. 流式细胞仪原理：发射激光-激发细胞上荧光标记的光源-散射光信号-过滤片

特点：单细胞，特异，快速（一般每秒200～500个细胞/颗粒为宜，每份样品细胞采集时间为30～60秒，采集细胞/颗粒总数不低于5000个细胞/颗粒。）

光学滤片放在光电倍增管前面，只让合适波长的光进入相应的光电倍增管。滤片是特制的，只允许很窄波宽的光通过，相当于荧光素发射波的峰值。

只允许特定波宽的光通过的滤片叫带通滤片（band pass，BP）。比如，放在FITC检测器前面的滤片标记为530/30，即是515～545nm波长的光可以通过。

流式细胞仪还会用到其他两类滤片：短通滤片和长通滤片。短通滤片（short pass，SP）只允许短于或等于设定波长的光通过；长通滤片（long pass，LP）只允许长于或等于设定波长的光通过。

488nm激光可以激发多个荧光素，是最常用的激光。几种荧光素如果由同一波长的激光激发（以488nm激光举例），而发射波长的峰值又不是太靠近，这几种荧光素可以组合使用。符合这一标准的最常用的荧光素组合是异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）。FITC和PE的吸收波峰在495nm左右，极易被488nm的激光激发（PE有两个吸收波峰，另一个是545nm），FITC 和PE的发射波峰分别是530nm和570nm，相距较远，可由不同的检测器检测

2.荧光染料的选择与常用的染色技术

Summary of fluorochromes selection

- Based on the kind of machine you have in hand, ie, the light source.

- Try to avoid the interference between fluorochromes. if you can't avoid it, set up the compensation.

由于FITC和PE发射波谱之间的重叠，部分FITC荧光会进入PE检测器，这部分信号叫溢出信号——从FITC检测器溢出到PE检测器。需要强调的是，不可能设计一种滤片只检测FITC光或PE光，只要有荧光染料的组合使用，就一定有荧光信号溢出。

选择试剂组合时尽可能降低荧光发射波长之间的重叠。如下图中间，同种PE不应该有CD检测强信号(假阳性)，是因为重叠了AF488。

因此，FITC标记时，在530nm，带通滤片的检测器能检测FITC荧光；在575nm，带通滤片的PE检测器同样可以检测到部分FITC荧光。PE标记时，也是同样的情况。如何计算多少575nm的光来自于PE，多少来自于FITC？这一计算过程就叫“补偿”。根据标记燃料的数目可分为单色补偿、双色补偿和多色补偿。计算补偿需要借助单阳性对照。

借助单阳对照完成“补偿”

分别检测可以避免假阳性

3.结果分析与流式图

流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道。

散射光通道有两个，FSC通道和SSC通道。FSC前向角散射，代表细胞的大小。体积越大，其FSC值就越大。用以初步比较细胞的大小，从而进行分群和分类。SSC侧向角散射，代表细胞的颗粒度。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。

荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，则需要标记荧光素偶联的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收，就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子，以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，细胞表面表达的CD分子就越多。总之，荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，从而反映细胞上结合的荧光素的量，进一步反映细胞上表达该CD分子的量，最后间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征。

图4是一个典型的双荧光参数点图，显示了三群细胞：绿色细胞群表示CD3+CD4+细胞，红色细胞群表示CD3+CD4-细胞，蓝色细胞群表示CD3-CD4-细胞。

图4 双参数点图

- Based on the fluorescence intensity and antigen density you will detect. Match brightest fluorochromes with dimmest antigen.

Common antigens

- Avoid potential factors that may affect the experiment. Tandem dyes with degradation lead to false positive(降解脱偶联）and autofluorescence（细胞自发荧光）.

解偶联造成PE阳性

4. 荧光素偶联抗体及其标记方法

荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体。但无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，其基本结构都是由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段。

应用荧光素偶联抗体标记样品细胞，目标是检测Fab段与抗原分子的特异性结合。Fc段与FcR的非特异性结合是混杂信号，会导致流式分析结果错误，所以需要消除这种非特异性结合的影响。消除的方法就是在用荧光素偶联抗体标记样品细胞前先“封闭”样品。考虑到目前常用的荧光素偶联抗体基本都是IgG抗体，所以可以用无关IgG抗体先与样品细胞孵育一段时间，使样品细胞上的所有FcR都与无关IgG抗体的Fc段非特异性结合，然后再标记荧光素偶联抗体，这时样品细胞上的FcR都已饱和，无法与荧光素偶联抗体的Fc段结合，从而“封闭”了与荧光素偶联抗体的非特异性结合，保证所有的结合都是抗原与荧光素偶联抗体的特异性结合。

附录

1. Autofluorescence 对Compensation 的影响：http://www.drmr.com/compensation/