正常T细胞在行使杀伤作用前会与靶细胞结合，并在结合区形成免疫突触。同 样地，CAR-T细胞也会靶向肿瘤细胞，并与靶细胞形成类似的免疫突触并启动免 疫反应。其主要通过以下三种机制杀伤肿瘤细胞： ① CAR-T细胞分泌穿孔素和颗粒酶，穿孔素可以在肿瘤细胞表面“打洞”，随 后颗粒酶被输送至肿瘤细胞内部，通过物理作用直接杀伤肿瘤细胞或诱导肿 瘤细胞发生凋亡； ② CAR-T细胞表面会高表达TNF（肿瘤坏死因子）配体，这些配体可以诱导肿 瘤细胞凋亡； ③ CAR-T细胞会分泌特定的细胞因子，这些细胞因子可以加强CAR-T细胞的 活性，进而改变肿瘤微环境，增强抗肿瘤活性。
CAR 结构设计
CAR的模块化设计包括四个主要组成部分：抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号区。每个组分都具有独特的功能，通过对组分蛋白的多种变化可以实现CAR的最优分子设计。
1. 共刺激域
结构组成：CAR中使用的大多数共刺激分子属于Ig超家族，如CD28和ICOS，或TNF受体超家族(TNFRSF)，如4-1BB、OX40和CD27。
功能：共刺激域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。如CD28共刺激域使CAR-T细胞依靠糖酵解代谢，促使CAR-T细胞向效应T细胞分化。而4-1BB共刺激域促进线粒体生成，增强呼吸作用和脂肪酸氧化，抗原刺激后，CAR-T细胞优先分化为中央记忆T细胞。
4-1BB4-1BB（CD137）是一种重要的T细胞共刺激分子，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族。它在T细胞表面表达，并通过与其配体4-1BBL的结合来激活T细胞，促进T细胞的增殖和活化，同时抑制活化诱导的细胞凋亡（AICD），增强T细胞的免疫杀伤功能。4-1BB的信号转导依赖于TRAF蛋白，特别是TRAF1和TRAF2，它们参与形成异源三聚体并激活下游信号级联，包括JNK/SAPK和P38 MAPK，进而通过转录因子NF-κB调节4-1BB信号，促使细胞因子的产生和分泌。在结构上，4-1BB具有一个单一的跨膜域，一个含有二硫键稳定的半胱氨酸富集结构域（CRDs）的细胞外域，用于配体结合，以及一个含有不同信号传导基序的细胞内信号域。人类4-1BB以二硫键连接的二聚体形式存在，而小鼠4-1BB主要以单体形式表达。人类4-1BBL在细胞膜上以同源三聚体形式存在，而小鼠4-1BBL以共价连接的二聚体形式存在。人类4-1BB/4-1BBL的结合形成一个异源六聚体构象，其中由4-1BBL形成的三聚体与三个4-1BB分子结合。4-1BB在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值，尤其是在CAR-T细胞疗法中。通过在CAR的胞内域添加4-1BB共刺激结构域，可以增强T细胞的持久性和抗肿瘤活性。此外，4-1BB信号通路的激活还涉及到与半乳糖结合蛋白（galectins）的相互作用，如Galectin 9和Galectin 3，它们在调节4-1BB/4-1BBL信号复合体形成中起作用。在抗体药物开发中，4-1BB激动型抗体如urelumab和utomilumab已经进入临床试验，尽管它们的疗效和安全性仍在研究之中。4-1BB的共刺激结构域也被用于CAR-T细胞疗法的开发，以增强T细胞的活性和持久性。
2.信号转导结构域（Signaling Domain）
结构组成：信号转导结构域通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs）。
功能：发挥T细胞信号转导功能，触发下游信号级联反应。
CD3ζ
CD3ζ是T细胞受体（TCR）复合体的一部分，其信号结构域在T细胞激活和信号传导中起着至关重要的作用。以下是CD3ζ信号结构域的几个关键功能：
信号传导：CD3ζ的胞内结构域含有三个免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs）。当TCR与抗原肽-MHC复合物结合时，CD3ζ的ITAMs会被磷酸化，从而传递激活信号给T细胞。
增强T细胞活性：在CAR-T细胞疗法中，CD3ζ作为CAR的胞内信号传递结构域，与TCR的信号传导协同作用，增强了T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。
CAR-T细胞设计：在CAR-T细胞的设计中，CD3ζ的胞内结构域常被用作激活结构域，以启动信号转导，驱动T细胞毒性功能。例如，Tisagenlecleucel和Axicabtagene ciloleucel等FDA批准的CAR-T产品均采用了CD3ζ作为信号传递结构域。
影响CAR-T细胞的疗效：研究表明，使用CD3ζ链中的1个ITAM结构域而不是全长，可以获得更强的肿瘤抑制活性，这可能为未来CAR结构设计提供新的思路。
与其他共刺激分子的协同作用：在CAR设计中，CD3ζ常与共刺激分子如CD28或4-1BB的胞内信号传导结构域结合使用，以增强CAR-T细胞的增殖、细胞因子分泌以及持久性，从而提高疗效。
形成同源二聚体或异二聚体：CD3ζ跨膜域能够使CAR形成同源二聚体或与内源TCR形成异二聚体，这有助于增强CAR-T细胞的活性。
综上所述，CD3ζ的信号结构域在T细胞的激活、信号传导以及CAR-T细胞疗法中发挥着核心作用，是连接抗原识别与T细胞激活的关键桥梁。
[if !supportLists]3. [endif]铰链区
结构组成：大多数CAR的HD由IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区衍变而来。基于IgG的铰链通常使用IgG分子的铰链-CH2-CH3区域，主要是IgG1和IgG4。
功能：连接scFv和跨膜结构域，作为一种间隔物，将scFvs保持在质膜之外，并赋予它们进入靶细胞表面抗原表位所需的灵活性。CAR对抗原的有效识别依赖于HD的长度和靶表位与细胞膜的距离。调整HD长度可以使CAR-T细胞和靶细胞处于最佳距离，在抗原抗体结合过程中避免大型磷酸酶的作用减弱CAR信号。在某些情况下，抗原表位可能相对不可接近，需要使用更长的铰链区，使scFv可以克服空间位阻，有效结合抗原。因此，抗原表位不同，铰链区的最佳长度也不同，在靶向新抗原时需要相应地调整铰链区的长度。免疫球蛋白重链CHl和CH2功能区之间的区域铰链区指免疫球蛋白重链CHl和CH2功能区之间的区域。含大量脯氨酸，具有弹性。适于与抗原结合，也与补体活化有关。铰链区是组成IgG、IgA和IgD类免疫球蛋白分子的一种结构域，位于CH1和CH2间，连接Fab和Fc段。该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。铰链区（hinge region）不是一个独立的功能区，但它与其客观存在功能区有关。铰链区位于CH1和CH2之间。不同H链铰链区含氨基酸数目不等，α1、α2、γ1、γ2和γ4链的铰链区较短，只有10多个氨基酸残基；γ3和δ链的铰链区较长，约含60多个氨基酸残基，其中γ3铰链区含有14个半胱氨酸残基。
[if !supportLists]4. [endif]抗原识别结构域（scFv）
结构组成：抗原识别结构域是CAR特异性结合肿瘤抗原的基础，其主要结构是scFv，由单克隆抗体的轻链（VL）和重链（VH）通过多肽连接而成，保留有抗体对抗原的特异性和亲和力。
功能：scFv赋予了T细胞特异性识别并结合靶抗原的能力，与未经修饰的天然TCR-T细胞相比，其对靶抗原的亲和力显著提高。CAR-T细胞通过scFv对靶抗原的识别结合不依赖MHC抗原呈递，一方面避免了肿瘤细胞通过调节MHC分子发生逃逸，另一方面赋予了CAR-T细胞识别非肽抗原的能力。
scFV 抗体
单链抗体（Single chain Fv，ScFv）是由一段弹性连接肽（Linker）把抗体可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位，以分子量小（仅为完整抗体的1/6）、穿透力强、体内半衰期短、免疫源性低、可在原核细胞系统表达以及易于进行基因工程操作等特点而备受关注，近年来已在生物学、医学领域、实验室研究及疾病的诊治方面取得了长足的进展。但单链抗体常常又存在亲和力低、功能单一、稳定性较差、体内清除过快等不足，使它的广泛应用受到一定限制。因此，近年来在ScFv的基础上发展了结合性能良好的ScFv多聚体-Diabodies、Tribodies及Tetribodies等，这些多聚体之间的转换仅依赖Linker长度的变化，氨基酸从12个缩至0，则Diabodies转换为Tribodies，Tetribodies。这些多价、多效能、高亲和力的新型小分子抗体较单链抗体具有诸多优势，有关其制备及应用已进行了较深入的研究。单链抗体（Single chain fragment variable, scFv）是一种基因工程抗体，在研究、诊断和临床应用等领域展示出广阔的前景。scFv的分子量约为28kDa，由抗体的重链（VH）可变区和轻链（VL）可变区通过一段10~25个氨基酸的柔性短肽（linker）连接而成。VH和VL各自包含3个互补决定区（CDR），即CDR1、CDR2和CDR3。由于CDR的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。VH与VL的6个CDR共同组成Ig的抗原结合部位，决定了一个抗体的特异性。
ScFv多聚体Linker的设计
ScFv的Linker一般为15个氨基酸，常选用甘氨酸和丝氨酸构成一段具有一定弹性及蛋白酶抗性的多肽Linker，其序列为（GGGGS）3。Linker的作用是既连接VH、VL，又保持一定的弹性，使VH与VL的功能区之间在折叠后仍可配对，构成单价抗原结合位点。当Linker缩短为3-12个氨基酸时，同一ScFv分子的VH与VL区就不能相互配对，而使来自不同分子的VH与VL功能区配对成一个二价的二聚体，即Diabodies；当Linker被进一步缩短为0-2个氨基酸时，VH的C端残基就直接与VL的N端残基相连，先由两个ScFv分子构成一个Diabodies，两端游离的VH、VL就与第三个ScFv分子构成一个三价的三聚体，即Tribodies。
ScFv多聚体的特性
Diabodies分子约为60KD，Tribodies分子约为90KD，均显著大于ScFv分子的30KD。因此在体内应用时具有许多优势，克服了ScFv在体内清除过快的不足。与ScFv及Fab小分子抗体相比，ScFv多聚体的显著有点就是它的高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。影像多价结合力的另一因素是多聚体中Fv分子的排列方向，通过比较VH-VL与VL-VH基因结构方向的Fv分子的结合活性，发现前者是后者的10-20倍。此外，细胞表面的几个靶抗原结合位点方向的一致性也至关重要，它保证了多价Fv分子有同时与之发生高亲和性结合，这在某些新型药物设计时尤为重要，使其能与同一细胞或相邻细胞膜表面受体发生交联，从而激活细胞，达到治疗目的。
ScFv多聚体的应用
双特异性Diabodies以其双重抗原结合特异性成为免疫诊断及免疫治疗方法中的新的组成部分，具有广阔的应用前景。它是由两种不同ScFv分子构成的Diabodies，具有双特异性，可同时与两种抗原特异性结合。与以往的双特异性抗体相比，双特异性Diabodies既保持了特异性结合抗原的特点又具有以下优点：首先，Fc区的缺失减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的机会；其次，由于体积小，最大限度地降低宿主的抗异源抗体反应；第三，分子量小，有利于对肿瘤组织的穿透力；第四，制备简便，可绕过细胞杂交这一费时费力的工程，无需使化学交联剂，从而避免了潜在的免疫原性和致畸性，同时也为人源性双特异性抗体的开发奠定了基础。在介导免疫细胞的细胞毒性作用方面，双特异性Diabodies能够双重识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞上的特异性抗原，将效应细胞集中在肿瘤部位，并启动信号传递，激活效应细胞发挥抗肿瘤作用。可被双特异性Diabodies介导的细胞毒性包括单核巨噬细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞。Diabodies的双特异性是设计免疫诊断试剂的良好素材。Kontemann等设计了几个Diabodies，其中一条臂为抗大肠杆菌半乳糖苷酶，另一条臂分别为抗蛋清溶菌酶（HEL）、抗CEA或抗HIV-1gp120，以这些Diabodies为酶结合物，用ELISA法检测HEL，免疫组化法检测CEA，免疫印迹法检测gp120，结果均能检出相应的抗原，说明双特异性Diabodies可用于酶免疫分析法。
scFv单链抗体制备
噬菌体展示技术是一种将scFv单链抗体或Fab抗体展示于噬菌体表面的抗体库制备技术，已广泛应用于抗原表位分析、抗体人源化、药物筛选、单克隆抗体制备和疫苗开发等领域。scFv单链抗体的制备流程：首先从杂交瘤（或脾脏、淋巴细胞和骨骼）中分离出mRNA，随后逆转录成cDNA，再经RT-PCR分别扩增抗体的重链及轻链基因，然后将抗体基因连入噬菌粒载体，构建scFv抗体库。利用生物淘选步骤，我们可获得具有高度亲和力和特异性的scFv抗体片段。在抗体发现项目中，scFv抗体片段表达和制备是一项常规工作。抗体基因完成测序后，scFv抗体可在原核系统（如E. coli）中进行表达，也可以通过转染在哺乳动物系统（即HEK293细胞）中进行表达。义翘神州可根据客户的要求，在不同表达系统进行scFv抗体片段的制备。常用的纯化标签为poly-histidine标签、FLAG标签、HA标签和Myc标签等。通常，将合适的纯化标签添加至scFv抗体片段的C端，另外，在设计表达载体时可在纯化标签和Fab之间加上蛋白酶切位点，方便后续纯化后去除标签。
