对 Signac-TF Footprint Plot 的理解与解释

生物背景：

snATAC-SEQ 数据由Tn5 转座酶 切割产生的DNA片段组成（fragments file）。这种酶倾向于在染色质的开放（可访问）的区域进行切割，这些区域的DNA不被组蛋白等蛋白质捆绑或结合。当转录因子（transcription factor，TF）与一段 DNA 区域结合时，该区域对 Tn5 的可及性会降低，因为 TF 会物理性地占据结合位点，从而阻挡 Tn5 的切割。

计算原理：

用于 snATAC-seq 数据分析的 Signac 包中提供了 Footprint() 函数用于对感兴趣的 motif 进行 转录因子（TF）footprint 分析，尤其是那些在特定比较中 富集于差异可及性峰（differentially accessible peaks） 的 motif。

Signac的 TF足迹分析 结果非常具有价值，因为它能够让我们在不进行多次 ChIP-seq 实验的情况下，基于概率估计多种转录因子的活性。在这种情况下，ChIP-seq 可以作为后续验证手段，用来确认足迹分析所提示的、可能在特定样本或条件下处于活跃状态的转录因子的真实活性。

TF足迹图解读：
通过 Signac 的 PlotFootprint() 函数，可以绘制 结合在富集 motif 上 的转录因子的 Footprint 图。

pacman::p_load(Seurat,Signac,dplyr,ggplot2)
sigObj <- qs::qread("xxx.qs")
DefaultAssay(sigObj) <- "peaks"
Idents(sigObj) <- "<select the conditions being compared.>"
### 假设以下一些 motif 显示出在选定的 DaPeaks 上显著富集
motifs_logo <- c(
    "NR1D2_1246#NR/19|nuclearreceptor|48|0",
    'CREM_188#CREB/ATF/1|bZIP|49|0',
    'CREM_190#CREB/ATF/1|bZIP|49|0',
    ...
)
sigObj <- Footprint(object = sigObj,motif.name = motifs_logo, in.peaks = TRUE,genome = BSgenome.Mfascicularis.NCBI.5.0)
### 绘制 Footprint 图
p <- PlotFootprint(sigObj, features = motifs_logo) + patchwork::plot_layout(ncol = 1)

以该 Footprint图为例：横轴表示相对于转录因子结合的 motif 的位置。位置 0 表示 TF 的精确结合位点，而左右的数值表示与结合位点的距离，分别向两侧延伸至 200 个碱基。纵轴上有两个使用相同横轴的子图：

上方子图：表示围绕所研究 motif 的 Tn5 切割频率富集情况，该富集程度反映了 DNA 的可及性。

在上方的子图中，我们可以看到，随着位置逐渐接近转录因子（TF）的结合位点，切割频率逐渐升高，并在靠近该位点时达到峰值。到了位置 0（即 TF 与 DNA 结合的确切位置）时，切割频率会急剧下降。这种形状像一个倒置的 “V”——两侧是峰，中间是谷。它的含义是：转录因子在结合位点上会物理性地屏蔽 DNA（形成谷），而在结合位点周围，由于染色质重塑作用（转录因子结合不仅是简单地“站在”DNA 上，它还会招募染色质重塑复合物（chromatin remodeling complexes，例如 SWI/SNF、ISWI 等，这些复合物会移走或滑动核小体，调整核小体间距，增加 DNA 可及性），使得 TF 周围的 DNA立即变得 更开放、更裸露，所以 Tn5 在这些区域切割的概率就上升，于是在 footprint 的两侧出现了比背景更高的切割频率（形成两侧的峰）。

下方子图：表示预期或理论上的 Tn5 切割分布（背景），显示在没有转录因子作用时预期的切割水平。

底部的图显示的是 在假设该区域没有转录因子（TF）结合干扰切割的情况下，Tn5 酶在该区域的预期切割水平。 “背景信号” 曲线—— 它反映了如果 TF 不存在，单纯从 DNA 序列、核小体布局或其他物理特性推测出来的切割分布。用它可以帮助校正上图实际观测到的切割频率图，去掉可能由序列偏好、技术噪音等带来的偏差，从而更准确地凸显 TF 结合信号的真实性。

在 TF footprint 分析中，这个“背景”是很关键的，因为 Tn5 本身对某些 DNA 序列有切割偏好，而且染色质结构本身也会造成切割差异，如果不扣掉背景，就可能把随机效果或技术伪影形成的足迹当成是由于TF的存在。

如下图所示为没有活跃TF时 Footprint 的情况：

观测数据中表现出平坦或均匀分布，类似于背景，说明该区域没有明显被 TF 结合影响；

观测数据与背景相比，结合位点的侧面没有明显的富集峰；

在实验数据的切割频率图中没有形成中央谷（central valley），切割率没有明显下降；

TF 足迹图的多组比较

在评估 TF footprint 图时，非常重要的一点是将 Tn5 的切割模式在不同样本或条件之间进行比较。通过这样的比较，才可以揭示转录因子在不同样本或条件下活性的潜在差异，从而了解哪些 TF 在特定状态下可能更活跃或被调控。

例如通过观察下图，我们可以做出一些判断，转录因子（TF）ZNF384 在两组间(01 和 02) 显示出了差异的 Footprint 活性特征：

将 ZNF384 FootPrint Plot 的观测数据与背景进行比较，我们可以进行如下 组间 Footprint 模式解读：

组 01（红线）：在结合位点附近（结合位点左侧）出现明显的峰，这种趋势与背景不同，尤其在倒置 “V” 区域附近，显示出潜在的足迹特征。这表明转录因子 ZNF384 在该组可能具有活性。

组 02（蓝线）：切割分布更接近背景，没有在结合位点附近出现明显峰值，分布平坦且均匀。这表明 ZNF384 在该组可能不活跃，或者活性较低，因为切割模式没有显示出结合位点周围的显著富集或中心保护。

$\therefore$ ZNF384 很可能在 组 01 活跃，切割模式显示出 footprint，结合位点周围有富集峰，且结合中心收到了切割保护。而在 组 02 活性较低，切割模式平坦且与背景相似，没有明显的 footprint 特征。

Reference

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aav1898
https://github.com/stuart-lab/signac/discussions/968
https://bioinformaticamente.com/2024/11/14/how-to-interpret-the-tf-footprint-plot/