转自公众号《单细胞天地》系列文章
标准流程
Read10X
CreateSeuratObject
PercentageFeatureSet
subset
NormalizeData
FindVariableFeatures
ScaleData#这一步骤在下游分析中具有同等的权重，因此高度表达的基因不会占主导地位
RunPCA
JackStraw
ScoreJackStraw
ElbowPlot
FindNeighbors
FindClusters
RunUMAP
FindAllMarkers
RenameIdents#亚群重命名
合并数据集
merge(x,y=,add.cell.ids=c(),project="")
基于标准化数据的合并
NormalizeData之后
merge函数添加merge.data = TRUE参数
整合分析
对两个或两个以上单细胞数据集的整合分析提出了独特的挑战。特别是，在标准工作流下，识别存在于多个数据集中的基因可能存在问题。Seurat v4 包括一组方法，以匹配（或"对齐"）跨数据集共同的基因。这些方法首先识别处于匹配生物状态的交叉数据集对（"锚点"），既可用于纠正数据集之间的技术差异（即批次效应校正），又可用于对整个实验条件进行比较scRNA-seq分析。
先NormalizaData、FindVariableFeatures再
FindIntegrationAnchors
IntegrateData
之后设置DefaultAssay为integrated
再进行ScaleData、RunPCA、RunnUMAP、FindNeighbors、FindClusters
识别保守的细胞类型标记
为了识别在各条件下保守的细胞类型标记基因，我们提供该功能。该功能为每个数据集执行基因表达检测，并使用 MetaDE R 包中的元分析方法组合 p 值
整合之后的差异分析，使用原先的data。DefaultAssay修改为RNA
FindConservedMarkers
参数的功能可用于查看跨条件下的保守细胞类型标记，显示表示任何给定基因在群中的表达水平和细胞百分比。
识别不同条件的差异基因
分完Idents之后FindMarkers
使用SCTransform整合数据
改进的整合方法
- 通过SCTransform()单独（而不是在整合之前）实现数据集标准化
- 我们使用 3，000 个或更多基因来进行sctransform 下游分析。
- 在识别锚点之前运行该功能PrepSCTIntegration()
- 运行FindIntegrationAnchors()和IntegrateData()时，设置参数normalization.method为SCT
- 当运行基于 sctransform 的工作流（包括整合）时，不运行该功能ScaleData()
对每个数据集进行SCTransform
SelectIntegrationFeatures 3000
PrepSCTIntegration
FindIntegrationAnchors
IntegrateData
RunPCA
RunUMAP
交互技巧
选择特定类型细胞取子集
WhichCells
计算群内的平均基因表达
AverageExpression
常用命令
数据可视化方法
marker基因可视化
RidgePlot
VlnPlot
FeaturePlot
DotPlot
DoHeatmap
FeaturePlot新增功能
可设置最大最小值的阈值；两个基因的热图(blend)；分组显示；
将主题应用于绘图
Seurat所有绘图功能默认情况下返回基于 ggplot2 的绘图
交互式（新功能，可探索）
细胞周期评分和回归分析
基于传统细胞周期相关marker计算细胞周期得分，并在预处理过程中将这些分数从数据中回归，以消除 scRNA-seq 数据中细胞周期异质性的影响
分配细胞周期得分CellCycleScoring()
我们根据每个细胞的G2 / M和S期marker的表达为其分配分数。这些marker集合在表达水平上应该是反相关的，不表达它们的细胞可能不会循环并处于G1期。
回归细胞周期得分ScaleData()
从数据中消除（“回归”）这种异质性。对于每个基因，Seurat计算模拟基因表达与S和G2M细胞周期得分之间的关系。该模拟的残差表示“校正后的”表达矩阵，可在下游用于降维分析。
可选工作流
上面的过程将删除与细胞周期相关的所有信号。在某些情况下，我们发现这会对下游分析产生负面影响，尤其是在分化过程中（如鼠类造血），在此过程中干细胞处于静止状态，分化的细胞正在增殖（反之亦然）。在这种情况下，将所有细胞周期效应消除，也会使干细胞和祖细胞之间的区别变得模糊。
作为替代方案，我们建议消除G2M和S期评分之间的差异。这意味着分离非循环细胞和循环细胞的信号将保留，但是增殖细胞之间的细胞周期差异（通常是不感兴趣的）将被从数据中剔除。
差异基因表达
降维
使用SCTransform
(1)单个命令替换了NormalizeData()，ScaleData()，FindVariableFeatures()
(2)能够得到log后较清晰的生物学差异。
(3)最新版本还支持使用glmGamPoi包，这大大提高了运行的速度。它可以通过指定sctransformmethod=glmGamPoi来调用。
