上期带大家了解了CRISPR文库筛选的多种压力手段。
有了这些“武器”，如何精准运用才是难题。合适的压力手段选择，关乎筛选能否高效、精准地揭示基因功能。本期我们将聚焦选择策略，从研究目的、细胞模型适配等维度切入，为大家提供一套系统实用的方法。
压力手段的选择策略
选择压力手段是一个高度依赖于具体研究问题的过程。以下是关键考虑因素：
1. 研究目的
核心问题：需明确研究生物学过程（如耐药、代谢、免疫反应）及目标基因类型（如耐药基因、合成致死伙伴）。
筛选策略：正向筛选（富集目标细胞）或负向筛选（耗竭非目标细胞）。
2. 细胞模型
原代细胞/难转染细胞：优先选择温和压力（如低浓度药物或代谢限制），避免细胞死亡过快。
永生化细胞系：可承受更高强度压力（如高浓度药物或辐射），以增强筛选灵敏度。
类器官或3D模型：选择模拟体内微环境的压力（如缺氧或免疫细胞共培养），以提升生物学相关性。
3. 压力强度与时间优化
剂量选择：压力强度（如药物浓度、缺氧程度、营养剥夺程度）必须足够强以产生明显的选择效应（富集/耗竭），但又不能强到在短时间内杀死所有细胞，导致无法观察到基因编辑带来的差异。通常需要预实验确定合适的剂量和时间点，使野生型细胞或对照细胞在该压力下有部分存活（例如IC50或IC70-90浓度）。
时间选择：压力施加的时间需要足够长，让基因编辑导致的表型差异（如生长速率差异）积累到可检测的水平。通常需要数天到数周，具体取决于细胞增殖速度和压力强度。时间过长可能导致非特异性的克隆效应或二次突变。
4. 表型的稳健性与可检测性
表型强度：所选压力需能产生足够强且可重复的表型，表型越强，筛选的信噪比越高，结果越可靠。
检测方法：sgRNA丰度的变化是最容易检测的。复杂的表型（如迁移）需要结合FACS或成像分选技术。
5. 对照设计与验证
无压力对照：平行培养一组细胞在正常条件下，用于鉴定基础生长必需的基因和评估筛选本身的技术噪音。
阳性/阴性对照：如果可能，包含已知在该压力条件下起作用的基因的sgRNA作为阳性对照（应被富集或耗竭），以及靶向无关或安全位点的sgRNA作为阴性对照（丰度应基本不变）。这有助于验证筛选系统的有效性。
重复实验：至少3次独立重复以确保结果可靠性。
6. 可操作性与成本效益
需考虑细胞量、培养条件、分选设备（如果涉及复杂表型）及测序深度是否在预算范围内。
7. 安全性与伦理
若涉及动物活体，需确保所使用的实验方法不会对动物产生不必要的伤害，符合《实验动物福利伦理审查指南》规定。
8. 文献依据
参考相关领域的前人研究，了解成功案例中使用的压力手段。
通过系统选择和优化压力条件，CRISPR文库筛选可高效揭示基因功能与特定生物过程或疾病状态之间的关键联系。研究需结合实验目标、细胞模型特性及技术可行性，确保筛选结果的可靠性与生物学意义。
