1. Mouse Model of Metabolic Stress-Induced HFpEF
由于ApoE KO-WD mice (常用于粥样硬化造模)常常出现与HFpEF相关的变化，如代谢失衡，作者首先探究了ApoE KO给予WD是否出现HFpEF(a)。结果显示给予WD的ApoE KO鼠出现了心脏向心性肥厚(b)，而EF正常(c)，并出现了舒张功能障碍(d)，舒张末期压力显著增加(e)。ApoE KO-WD小鼠的运动耐力也下降(f)，肺重量增加，提示充血(g)。此外，ApoE KO-WD小鼠在basal coronary flow不变的情况下出现了coronary flow reserve的下降，提示内皮功能障碍(h)。
冠脉血流从静息状态增加到充血状态，这种冠脉血流增加的能力被称为冠脉血流储备（Coronary Flow Reserve，CFR），是冠脉最大血流量和静息时血流量的比值。CFR反映了心外膜血管和微循环的整体情况，心外膜血管和微血管病变都会影响CFR的数值。
2. Characterization of Cardiac Immune Cell Subsets in HFpEF by Single-Cell Sequencing
为了探究ApoE KO-WD鼠是否存在促炎反应，作者分选了心脏CD45+细胞，进行了单细胞测序。21171个细胞被分为8种类型，以巨噬细胞最多(a-c)。对巨噬细胞的进一步分析得到4个亚群(d,e)，其中Timd4+群参与抗炎的核受体通路，MHChigh和CCR2+群参与促炎通路(f)。
3. Differential Gene Expression Analysis of scRNA-seq Data Sets Reveals the Effect of Metabolic Stress on Macrophages
接着作者探究了metabolic stress对巨噬细胞转录的影响，发现多种代谢激活和脂质沉积(Plin2, Abca1, Cybb)和经典炎症激活(Il6, Tnf, Il1a, Nlrp3)基因在HFpEF中高表达(附图)。
接着作者进行了轨迹分析并将WT-CD作为分化起始，发现WD对轨迹的影响较大，而ApoE KO的影响较小(a-b)。各种巨噬亚型在轨迹上的分布较均一，提示a homogeneous transcriptional response to metabolic stress (附图)。接着作者做了模块分析，寻找到与HFpEF condition相关的模块2，发现这个模块与多种炎性通路相关，如TLR, Trem1, TNFR2, IL6, IL1等(c)。且模块2中的多种基因都随着轨迹表达上调(d)。
接着作者对巨噬进行了差异分析，发现ApoE KO-WD (KO+diet) 小鼠的转录差异最大。仅仅是KO或者diet引起了一些代偿性变化，如NRF2介导的氧化应激、自噬等(e)。而KO+diet则引起了显著的炎性变化，如IL-1, IL-6, TGF-b, 细胞因子产生和氧化应激等(e)。
随后作者进行了SCENIC分析，发现多种TF参与ApoE KO和WD的调控，尤其是未折叠蛋白反应通路的TF如IRE1/XBP1, PERK/ATF4 和 ATF6 (f)。XBP1在WT-WD中显著升高，ATF4在WD组升高，在ApoE KO-WD更高。而ATF6仅在ApoE KO-WD显著升高(f)，提示心肌持续的不饱和脂肪酸累积会引起渐进性的内质网应激。持续的内质网应激可以导致细胞死亡，作者发现凋亡通路在HFpEF中也显著富集(g)。
这一部分的分析也就是轨迹+SCENIC，没什么特别的。而且全是所有巨噬一起做的，感觉前面那个巨噬细胞都多余分个亚群。
4. Cardiac Meta-Inflammation in Metabolic Stress-Related HFpEF
为了探究dyslipidemia是否参与心脏代谢的特殊变化并影响心脏促炎环境，作者对四组小鼠心脏左室组织进行了632个代谢物的检测。发现WD 7周的 ApoE KO 小鼠出现了最为显著的代谢变化(a)，44%的代谢物在ApoE KO-WD组中特异性变化，而且主要来自脂质代谢通路(a, b)。ApoE KO-WD鼠的心脏多不饱和脂肪酸显著下降，medium- 和 long-chain acylcarnitines (酰基肉碱)显著增加(c, d)。由于饱和脂肪酸和酰基肉碱具有促炎功能，而不饱和脂肪酸具有抗炎和心脏保护功能，这些变化提示心脏可能处于促炎状态。在变化最显著的代谢物中，长链饱和脂肪酸c12和c14及其酰基肉碱衍生物，在ApoE KO-WD鼠的心脏显著上调(e)。
为了探究是否这些保护脂肪酸可以促进巨噬细胞的促炎性，作者提起了 WT 和 ApoE KO 鼠的bmdm，使用laurate (C12), myristate (C14), 或两者一起干预了BMDM (f)。结果显示干预后BMDM的促炎性显著上升，多种促炎因子上调(g)。
Taken together, our data reveal the cellular basis of metabolic stress–driven macrophage activation, suggesting that changes in the local cardiac environment can skew macrophages toward an inflammatory phenotype.
5. Intercellular Communication Identifies a Macrophage-to-Cardiomyocyte Regulatory Axis
由于HFpEF最显著的特征是心室肥厚和收缩力改变，且ApoE KO-WD鼠存在显著的心脏肥厚(a)，而ApoE KO-
WD鼠的原代心肌存在舒张下降(b)，作者随后进行了巨噬和心肌的互做分析，以探究这种功能变化背后的机制。
作者分离了4组小鼠心脏的心肌细胞，进行了bulk RNA测序，鉴定出356个差异基因。做了NicheNet分析。356个基因中有57个被鉴定为巨噬细胞分泌的配体的靶点(c, d)（这个方法，感觉用的就是目标基因集的配体和靶基因活性预测分析）。对巨噬-心肌互做靶基因的通路富集结果显示多条心脏应激通路如肥大、纤维化、自噬、WNT/β-catenin等显著富集(f)。而这些基因如Fos, Myc, Irf1等，主要受到TNF-α, IL-15, IL-6等细胞因子调控(d)。文献报道IRF1在心肌种可以直接激活iNOS，驱动心肌功能失调。这些结果提示巨噬细胞释放的细胞因子可能可以直接介导心肌的nitrosative stress (硝化应激)。此外，TGF-β 和 BMP6 的互做可能调控心肌重塑(d)。而IL-15 与氧化应激反应基因如Fos, Sod 和 Mafk 之间的互做则可能通过NRF2氧化反应通路参与调控心脏功能失调(c, d)。与互做结果一致，直接使用TNF-α, IL-6, IL-15或三者联合干预，可以诱导原代心肌的相关靶基因表达(f)。
6. SGLT2i Dapagliflozin Blunts Myocardial Inflammation in Metabolic Stress–Related HFpEF
最后作者象想要探究靶向代谢的治疗是否可以缓解metabolic stress引起的心脏炎症和心衰。作者使用了SGLT2is (the most promising novel class of drugs for the treatment of HF)治疗ApoE KO-WD鼠。发现心功能改善，巨噬细胞减少，心脏炎症下降，氧化应激水平下降。
