研究背景
癌细胞释放的炎性介质促进骨髓细胞中免疫抑制和耐受的诱导。通过免疫检查点封锁（icb）治疗程序性细胞死亡蛋白1（pd-1）或其配体pd-l1来消除肿瘤，在癌症患者中产生了显著的临床益处。然而，癌细胞可以通过失去免疫识别机制或上调免疫抑制途径来对治疗产生耐药性。
IL-1受体相关激酶-3 (IRAK3)是一种抑制IL-1/TLR信号的假激酶，癌症衍生因子可以通过增强IRAK3表达来抑制人类骨髓细胞的激活，但尚不清楚IRAK3如何促进人类髓细胞的免疫耐受，并调节患者对免疫疗法的反应。。
本文在CRISPR/Cas9基因编辑后的原代人单核细胞和免疫活性小鼠中彻底研究了IRAK3的重要机制。结果表明IRAK3是骨髓细胞炎症状态的关键调节因子。免疫活性小鼠中IRAK3的基因缺失能够有效抑制肿瘤生长，并与ICB治疗协同作用。且在尿路上皮癌患者的临床数据集中得到了证实，其中预处理肿瘤组织中IRAK3的表达与炎症信号和ICB疗法的治疗结果相关。
研究设计
IMvigor210临床试验，对接受阿替唑单抗(一种经批准的ICB疗法)治疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的RNA测序数据
CRISPR/Cas9删除IRAK3蛋白的原代人单核细胞的定量蛋白质组
由CRISPR/Cas9创建的新型IRAK3 KO小鼠模型的体内实验
研究结果
1.根据IRAK3表达预测尿路上皮癌患者对ICB治疗的反应
在IMvigor210临床试验的RNA测序数据，测试了IRAK3的临床相关性。通过对IMvigor210队列中CD45低水平患者亚群(n = 75)的分析，发现在这些患者中，IRAK3表达与ICB反应无关。
因此，CD45低表达(n = 75)或应答数据缺失(n = 50)的患者被排除在后续分析之外(图1A)。通过计算IRAK3和CD45之间的比率产生IRAK3分数。根据治疗前IRAK3评分(图1A)对患者进行分层，并比较对治疗的反应。与疾病稳定或进展的患者相比，经历完全或部分反应的患者在治疗前显示出明显较低的IRAK3表达(图1B)。
使用CIBERSORTx进行了免疫去卷积分析。IRAK3评分低的肿瘤显示出促炎性免疫细胞亚群的显著富集，如M1样巨噬细胞、T滤泡辅助细胞、活化的CD4+记忆性T细胞、记忆性B细胞，而在IRAK3高的患者中单核细胞和肥大细胞更丰富(图1C)。
对差异表达基因的途径分析表明，在IRAK3评分高的患者中，TGFB信号放大、巨噬细胞活化改变和炎症反应。相比之下，在同一患者组中观察到适应性免疫减弱，抗原呈递减少，对免疫刺激性细胞因子的反应减弱(图1D)。相应地，参与TGFB信号传导的基因与IRAK3表达呈正相关，而参与适应性免疫激活的基因，如LCK、ZAP70和CD3，则呈负相关(图1E)。
2.IRAK3基因缺失改变了原代人单核细胞的翻译模式
使用CRISPR/Cas9基因组编辑研究了人类原代单核细胞中IRAK3的潜在机制。为了避免由于病毒转导引起的免疫激活，将重组Cas9蛋白与靶向人IRAK3基因的指导RNA(gRNA)共转染到人THP1单核细胞系中实现蛋白质缺失(图2A和B)。
用LPS处理后，原代单核细胞中IRAK3蛋白的表达增加，使用CRISPR/Cas9方案在供体中强烈抑制了这种表达(图2C)。在功能上，当在αCD3/CD28珠与原代人T细胞共培养时，IRAK3缺陷型THP1细胞诱导CD4+和CD8+ T细胞显著更高的增殖(图2D)。当原代人类T细胞与单核细胞在混合淋巴细胞反应中共培养时，观察到由IRAK3-KO单核细胞引发的T细胞增殖增加(图2E)。
富集分析表明，IRAK3蛋白缺失增强了人原代单核细胞对干扰素和病毒的反应(图2F)。当根据生物学功能分组时，观察到与干扰素信号相关的蛋白，包括MX2、IFIT3、IFI16、DTX3L、OAS3、RNF213和TRIM21，由于IRAK3蛋白缺失而在原代人单核细胞中上调(图2G)。
3.在原代人单核细胞中，TLR诱导的信号网络和细胞因子释放由IRAK3控制
对原代单核细胞进行的全面磷酸化蛋白质组学分析发现，由于IRAK3蛋白缺失，185个磷酸化位点发生了显著变化(图3A)。据报道，IRAK3缺陷细胞中的几种改变的磷酸化位点，如JIP4、HDGF和MYO9B，调节TLR途径。使用人类磷酸激酶阵列验证了磷酸蛋白质组学数据。如图3，B和C所示，IRAK3蛋白的缺失增强了ERK1/2、JNK、AKT、CREB和HSP27的磷酸化，所有这些都可以通过MAPK途径调节。
为了研究IRAK3蛋白缺失后增强的细胞内信号传导是否会改变人髓样细胞对TLR刺激的敏感性，建立了一种体外试验来定量原代单核细胞响应TLR激活而释放的可溶性因子(图4A)。观察到IRAK3 KO THP1细胞和原代单核细胞在对LPS治疗的反应中释放显著更高的IL-6、TNFA、CXCL10和IL-1B(图4，B和C)。
类似地，用TLR1/2激动剂(Pam3CSK4)或TLR7/8激动剂(R848)治疗导致在IRAK3蛋白缺失后，从原代人单核细胞产生的IL6和TNFA增加(图4D)。对92种炎症介质的进一步分析证实了CXCL10、IL-6和TNF的结果，并揭示了由IRAK3调节的其他因子，包括IL12B和IL6家族成员蛋白OSM和LIF、MMP10、IL-10和MCP2/4(图4E)。
4.CRISPR/Cas9导致的IRAK3缺失增强了巨噬细胞的促炎特性
为了剖析IRAK3在体内的作用，我们在C57BL/6NTac背景下使用CRISPR/Cas9创建了一个生殖系IRAK3-KO小鼠模型(图5A)。简而言之，gRNAs被设计成靶向小鼠IRAK3基因的4个外显子。选择具有最大缺失区域(9839 bp)的F1小鼠。
在未经治疗的BMM中，IRAK3缺失导致与免疫抑制性髓样细胞相关的基因(如MERTK和CD36)下调，细胞迁移基因(包括CCR7和CCL12)上调(图5C)。正如预期的那样，LPS诱导了BMM基因表达的实质性变化(补充图4B)，IRAK3-KO BMM证实了与促炎反应相关的基因的上调，如NOS2、IL-12A、CD80、CD86、IL-6、MX2和IRF1(图5、D和E)。因此，在TLR刺激后，IL-6和CXCL1向培养上清液的释放在IRAK3-KO BMM中显著增加(图5F)。
5.IRAK3调节先天免疫和适应性免疫的同时激活抑制了体内肿瘤的生长
为了测试IRAK3缺乏是否对肿瘤生长有影响，在年龄匹配的WT或IRAK3 CRISPR-KO小鼠中皮下注射同系鼠癌细胞系(图6A)。鼠乳腺癌细胞系EO771和肺癌细胞系LLC1在IRAK3-KO小鼠中显示出显著的生长延迟，导致携带LLC1肿瘤的小鼠存活时间延长(图6B)。
为了建立低突变负荷的肿瘤模型，我们采用了来源于转基因小鼠自发肿瘤的癌基因驱动的细胞系，即Ret黑色素瘤细胞系(17)和MYCN扩增的成神经细胞瘤细胞系9464D。如图6C所示，Ret黑色素瘤表现出侵袭性生长行为，而9464D肿瘤具有较长的发病期。
使用抗鼠CSF-1R的髓样细胞去除抗体测试了对肿瘤生长的谱系特异性作用。骨髓细胞的去除逆转了Ret黑色素瘤携带IRAK3-KO小鼠的肿瘤生长延迟，但对野生型小鼠没有影响(图6D)。
为了使用流式细胞仪评估肿瘤驱动的免疫学变化，选择了在WT和IRAK3-KO小鼠中显示出可比生长率的EO771肿瘤(图6E)。通过使用多元分析，确定了几个与肿瘤体积直接相关的免疫群体。
在不受肿瘤体积影响的细胞群中，观察到IRAK3-KO小鼠肿瘤中活化的树突细胞和巨噬细胞(CD86+MHCII+)显著富集(图6F和补充图5，B和C)。此外，共表达PD-1和CD38的CD8+ T细胞亚群仅在肿瘤组织中发现，并且由于IRAK3缺失而显著上调(图6G)。这两种细胞群在携带IRAK3-KO肿瘤的小鼠中表现出很强的相关性(图6H和补充图5D)。在荷瘤小鼠的脾脏中，观察到FoxP3阴性CD4+ T细胞中CD38+细胞显著升高(图6I)。
6.IRAK3的缺失触发了响应ICB疗法的抗肿瘤免疫的局部和整体重塑
为了在小鼠模型中研究ICB疗法的抗肿瘤效果，选择了MYCN驱动的小鼠神经母细胞瘤细胞系9464D，因为它具有低突变负荷，并且对ICB治疗没有反应 (图7A)。与早期结果一致，IRAK3的种系缺失导致用同型对照抗体治疗的小鼠中肿瘤生长延迟(图7A)。
用流式细胞仪评估了肿瘤和脾脏的免疫学变化。数据显示，与抗PD-1处理的野生型小鼠相比，用PD-1封闭抗体处理的IRAK3-KO小鼠中的TCF1+PD-1+干细胞样CD8+ T细胞显著增加(图7B)。在该组中，FoxP3– CD4+ T细胞中 CD25+PD-1 neg细胞的频率显著增加。此外，肿瘤组织中树突状细胞的激活和CD38+细胞毒性T细胞的频率因IRAK3-KO小鼠中的PD-1阻断而显著升高(图7C)。
在这些小鼠的脾脏中，髓样细胞的激活是由IRAK3缺失或PD-1阻断单独驱动的(图7C)。为了排除肿瘤大小引起的免疫变化，采用了对PD-1阻断敏感的EO771乳腺癌模型。如图7D所示，40%的抗PD-1处理的对照小鼠或60%的同种型处理的IRAK3-KO小鼠无肿瘤。值得注意的是，5只IRAK3-KO小鼠中有4只(80%)在抗PD-1治疗后没有显示出可检测的肿瘤。
当比较脾脏的免疫学变化时，抗PD-1治疗或IRAK3缺失导致TCF1+PD-1+干细胞样CD8+ T细胞显著增加。值得注意的是，接受PD-1封闭抗体的IRAK3-KO小鼠中的这一群体明显高于其他组(图7E)。与携带9464D模型的脾脏相似，IRAK3基因缺失增加了携带EO771小鼠中活化树突细胞的百分比，但PD-1阻断没有进一步扩大该群体(图7E)。
结论
IMvigor210临床试验，对接受阿替唑单抗(一种经批准的ICB疗法)治疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的RNA测序数据，发现具有高IRAK3表达的肿瘤显示出丰富的抗炎途径和对ICB疗法更差的临床反应。
CRISPR/Cas9删除IRAK3蛋白的原代人单核细胞的定量蛋白质组，表明IRAK3蛋白缺失增强了人原代单核细胞对干扰素和病毒的反应，在刺激反应中释放更多的促炎细胞因子。
由CRISPR/Cas9创建的新型IRAK3 KO小鼠模型的体内实验，表明IRAK3缺乏延缓了致癌物诱导的和致癌基因驱动的鼠癌细胞的生长，并诱导了髓样细胞和T细胞的增强活化，证明了IRAK3是骨髓细胞特异性免疫检查点。
证明了由IRAK3在人类和小鼠中控制的一种新的癌症驱动的免疫耐受程序，并提出了其作为免疫治疗靶点的适用性。
