胰腺导管腺癌(PDAC)是一种致命的疾病，在治疗上体现出很高的耐药性。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在PDAC中起关键作用，但其多样性阻止了治疗性开发。文章指出，可以通过阻断PGE2或IL-1β+活性进行TAM重编程，抵消肿瘤内外的炎症，从而控制PDAC进展。

雷纳托·奥斯图尼(Renato Ostuni)，就职于意大利圣拉斐尔特里松基因疗法研究院 (San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy in Italy)，在博士期间为发现CD14作为炎症细胞对细菌分子LPS的生化和细胞生物学反应的关键调节因子做出了贡献(Nature 2009、Cell 2011、JCI 2012)。后发现一类控制活化巨噬细胞中短期转录和表观遗传免疫记忆的调节元件——潜伏增强子(Cell 2013)。目前，Ostuni任先天免疫系统基因组学组组长，其团队致力于巨噬细胞激活的基因组控制(Nature Immunology，2017年)和人类先天免疫系统的发育。

1. Identification of IL-1β+ TAMs in PDAC

Fig 1a-c： 作者对新鲜分离的来自naive 或 chemotherapy treated PDAC 患者肿瘤组织进行了单细胞测序，得到了59,569个细胞(Extended Data Fig. 1a,b)。作者对TAM进行了2次聚类，得到6个亚群。其中IL1β+TAM显著富集到炎症反应 (IL1B, TNF, NLRP3 and PTGS2)，白细胞招募 (CXCL1, CXCL2 and CCL3) 和血管生成 (VEGFA, THBS1 and PDGFB) programmes，但是IFN和抗原呈递通路则显著下调。
Fig 1d：随后作者构建了IL-1β+ TAMs signature，在TCGA数据库中检测了其表达情况，发现IL-1β+ TAMs signature的高表达与PDAC患者更差的预后显著相关。
These data uncover IL1β+ TAMs as a subset of PDAC macrophages expressing inflammatory and non-cytotoxic programmes, whose abundance correlates with poor prognosis.

2. IL-1β+ TAMs are conserved in mouse PDAC

随后作者对PDAC小鼠模型(Kras^G12D/+ Trp53^R172H/+ Pdx1^Cre/+ , KPC)不同时间点的外周血，胰腺，肿瘤组织进行了单细胞测序。注释结果显示与人PDAC的TAM细胞群非常相似。
Fig 1e： 结果显示Il1b+ TAMs 在小鼠 PDAC 中早期即存在并且长期持续存在。
Fig 1f： 流式验证了PDAC组织中这群细胞的存在。
Fig 1g： 小鼠 IL-1β+ TAMs 表达 CD64, CD11c, MHCII 和共刺激分子 CD80 和 CD86, 以及肿瘤中的免疫失调marker 如CD206，ARG1和免疫检查点抑制剂PD-L1。
Thus, IL-1β+ TAMs are a conserved macrophage population that co-expresses inflammatory and immune inhibitory markers.

Fig 1

3. A monocytic origin of IL-1β+ TAMs

Fig 2a, b： 随后作者整合了外周血、胰腺和肿瘤的数据，以探究了IL-1β+ TAMs的来源。CellRank结果显示IL-1β+ TAM是外周来的，而不是原位TAM分化的。
Fig 2c： 在小鼠和人PDAC中，单核细胞进入肿瘤组织后开始上调这些 transcripts，并逐渐获得了 IL-1β+ TAM identity。
Fig 2d： 与此一致，外周血单核细胞的IL1B表达较低，招募进肿瘤组织后则显著表达上调。
Fig 2e： 随后作者使用了Ms4a3^cre-Rosa^TdT示踪鼠，这种小鼠的粒细胞-单核细胞前体细胞也就是GMP和它们的后代都会被tdTomato标记。结果显示The vast majority of IL-1β⁺ TAMs 是 tdTomato⁺，提示这些细胞是循环单核细胞来源的，随后浸润进肿瘤并暴露在TME的微环境中。

4. PGE and TNF elicit IL-1β+ TAMs

作者观察到在单核细胞向IL1B TAM分化过程中IL1B和TNF反应的显著富集，IL1B和TNF在患者PDAC组织中也显著高表达。但是体外对BMDM细胞给予IL1B或TNF刺激并没有诱导IL1B的表达，这意味着IL-1β+巨噬细胞的转变需要其他因子的协助。
Fig 2f： 此前有文献报道PGE2在巨噬细胞中可以诱导IL1B的表达同时抑制干扰素的表达，因此作者检测了PDAC患者以及小鼠肿瘤组织中PGE2的表达，显示存在显著高表达。而且PGE2-induced genes在IL1B TAM中显著高表达（附件）。
Fig 2g： 因此作者探究了PGE2是否参与诱导IL1B TAM。结果显示单独给予 PGE2 不能诱导IL1B的高表达，但是同时给予PGE2和TNF而不是PGE2和IL1B可以显著诱导BMDM高表达IL1B。

Fig 2h-j： RNAseq结果显示PGE2和TNF协同诱导的BMDM，其高表达的program很多都与IL1B TAM类似，如诱导 tumour-promoting inflammation 的基因 (Il1b 和 Il6) 同时抑制细胞毒性免疫 (Il10), 或刺激 prostaglandin 合成 (Ptges 和 Ptgs2), 髓系细胞招募 (Cxcl1, Cxcl2 和 Cxcl3) 和组织修复 (Areg, Arg2, Wnt11 和 Il33)。
Fig 2k： 对BMDM培养上清的多种蛋白的 elisa检测得到了一致的结果，PGE2和TNF协同诱导下，BMDM的IL-6 和 IL-10 表达增加，而 CCL5, CXCL10, CXCL11 和 CXCL16 这些招募 cytotoxic T 和 NK 细胞的趋化因子表达则下降。
These data identify PGE2 and TNF as TME factors that are able to cooperatively elicit the IL-1β⁺ TAM state in PDAC.

Fig 2

5. IL-1β+ TAMs accumulate in hypoxic areas

Extended Data Fig. 5a-c： 原位PDAC的免疫荧光分析结果显示 IL1β+ TAMs 优先分布在肿瘤核心周围富含成纤维细胞的基质区域，并且在小鼠肿瘤和人PDAC中的早期时间点也可以检测到这一分布特点。
Extended Data Fig. 5d-g： 所以作者对小鼠PDAC样本进行了空间转录组测序。结果显示IL-1β+TAMs与CD31+VEGFR2+内皮细胞和缺氧区域接近。因此推测出IL-1β+TAMs在PDAC的炎症、血管生成和缺氧区域发生局部特异性分化，并与高PGE2和TNF协同活性相关。
Extended Data Fig. 5h-k： Spatial principal components (sPC) analyses discriminated spots enriched in IL-1β⁺, FOLR2⁺ or SPP1 TAMs⁺.
Extended Data Fig. 5l： Projection of signatures of genes synergized by PGE2 plus TNF showed broad overlap with spots enriched in IL-1β+ TAMs.
Extended Data Fig. 5m-n： IL-1β⁺ TAM regions were enriched in GO terms associated with inflammation, hypoxia, angiogenesis and wound healing.
Extended Data Fig. 5o-p： 免疫荧光也得到了一致的结果，显示 the proximity of IL-1β⁺ TAMs to CD31⁺VEGFR2⁺ endothelial cells and hypoxic areas.
We conclude that IL-1β⁺ TAMs undergo local specification in inflamed, angiogenic and hypoxic regions of PDAC associated with high PGE2 and TNF synergistic activity.

Extended Data Fig. 5

6. PDAC-derived PGE promotes tumour growth

用COX2选择性抑制剂塞来昔布处理免疫功能正常小鼠，降低了PDAC中PGE2的水平，减少了IL-1β+TAM和单核细胞的积累，增加细胞毒性GZMB+CD8+T细胞的浸润，延缓肿瘤生长。
Fig 3a-b： 研究构建了COX2基因敲除(KO)的PDAC细胞系，该细胞系不能产生PGE2，但在体外没有表现出活性或增殖缺陷。将COX2-KOPDAC细胞或球体移植到免疫功能正常的小鼠体内，其生长受到CD8+T细胞和NK细胞控制，并伴随肿瘤引流淋巴结中淋巴细胞的活化增加。尽管中性粒细胞频率减少，但两组免疫细胞组成在疾病早期阶段基本相似。
Fig 3c： 对COX2-KO肿瘤的单细胞测序数据也显示IL-1β⁺ TAMs 表达关键特征基因和炎症基因基因都下降，并具有干扰素反应特征。这说明PDAC来源的PGE2在推动IL-1β+TAM状态中发挥了关键作用，还表明靶向COX2以非干扰素依赖的方式推动TME重编程，控制疾病进程。

7. Pathogenic IL-1β signalling in PDAC cells

Fig 3d-f： IL-1β 中和抗体 led to delayed PDAC growth, concomitant with reduced IL-1β expression by monocytes and TAMs and increased activation of cytotoxic T cells in draining lymph nodes.
Fig 3g： IL1R1-KO KPC cells showed a markedly reduced capacity to form tumours in immune-competent mice, concomitant with reduced infiltration of IL-1β⁺ monocytes and increased activation of CD8 T cells.
Fig 3h： Re-expression of IL1R1 in gene-targeted PDAC cells rescued tumour growth in vivo.
Fig 3i： Finally, stimulation with IL-1β promoted organoid generation by control PDAC cells, and not by IL1R1-KO PDAC cells, and explants of IL1R1-KO tumours showed defective organoid-forming efficiency.
These data highlight a requirement for tumour cell-intrinsic IL-1β signalling for PDAC growth.

8. Inflamed PDAC and TAMs engage in a loop

Extended Data Fig. 8a： RNAseq结果显示IL1B干预的KPC细胞显著上调了编码髓系生长因子的基因Csf1和Csf2，趋化因子Ccl2，细胞因子Tnf和具有免疫调节功能的酶Ptgs2和Nos2。ELISA检测也得到了一致的结果。
Extended Data Fig. 8b：为了评估这些分子的功能，作者对Ccr2^−/−鼠进行了 tumour challenge experiments，同时对WT鼠给予了 CSF-1的中和抗体治疗。 两个实验都引起了肿瘤生长减慢，提示单核来源的巨噬在PDAC中起到重要作用。
Extended Data Fig. 8c： IL1B干预的KPC细胞显著富集到炎症相关通路和Prostaglandin分泌通路。与A图中诱导TNF和PGE2表达相一致。
Extended Data Fig. 8d： 接着作者进行了supernatant transfer experiments，使用了IL1B，在有和没有COX2抑制剂的条件下培养KPC细胞，随后取出培养基，并在培养基中加入TNF抑制剂和对照，来干预BMDM细胞。结果显示TCM from untreated KPC cells 并没有促进巨噬细胞表达 Il1b，this gene was induced in response to TCM of IL-1β-stimulated tumour cells。Inhibition of COX2 in KPC cells treated with IL-1β led to lower induction of Il1b in BMDMs exposed to the corresponding TCM, with this occurrence being even more evident upon neutralization of TNF.
这些数据表现了PDAC细胞和巨噬细胞之间的自我维持回路，即随着肿瘤细胞中IL-1β+信号释放，单核细胞被招募到肿瘤中，引发IL-1β+TAM状态。

Extended Data Fig. 8

9. Early inflammatory reprogramming of PDAC

整合用细胞因子处理的PDAC细胞和类器官的scRNA-seq数据，以定义肿瘤内源性IL-1β+签名基因(T1RS)。T1RS在小鼠和人类PDAC转录组中富集，并与TCGA中IL-1β+TAMs丰度及TCGA中的低存活率相关。原位PDCA的纵向scRNA-seq分析显示肿瘤细胞中T1RS在早期时间点上调，预示疾病呈指数型增长，并获得增殖、上皮-间质转化(EMT)和细胞外基质重塑方案。

对胰腺肿瘤发展模型小鼠的基因表达数据显示，T1RS基因在小鼠良性胰腺上皮内病变(PanIN)的细胞中表达最高，在已建立的PDAC和远端转移灶中维持较高水平。遗传性或特发性慢性胰腺炎患者的巨噬细胞亚群也显示出类似于IL-1β+TAMs的基因表达程序。对caerulein诱导的胰腺炎小鼠的正常或Kras突变细胞分析发现T1RS的表达显著增加，且治疗几个月后仍有增高。因此可以推断炎症重编程和T1RS表达发生在肿瘤发生早期，会导致疾病进展和患者不良预后相关的持续转录变化。

Fig 4

9. IL-1β+ TAMs colocalize with T1RS+ PDAC

分析PDAC患者scRNA-seq数据发现有T1RS高水平表达的肿瘤细胞。通过伪时间分析将T1RS+PDAC确定为一个由T1RS本身以及已知的IL-1β+靶基因(如NFKBIA、IL1RN和CXCL1)表达逐渐增加驱动的基因表达轨迹的终点。且T1RS+PDAC细胞的预测发展还与肿瘤标志物的增加和胰腺肿瘤发生相关的GO术语有关，强调了炎症重编程与肿瘤细胞获得致病程序之间的内在相关性。

利用人PDAC中的单细胞空间基因表达鉴定巨噬细胞和肿瘤细胞之间的局部相互作用，发现CXCL1与KRT19和标记巨噬细胞(CD68)的基因，以及IL-1β+ (IL1B、IL1A和THBS1)和PGE2(PTGS2和PTGER1)存在明显的空间共表达；与其他巨噬细胞亚群相比，IL-1β+TAMs标志性基因的相关性更高。配体-受体相互作用分析结果显示了IL-1β+TAMs与T1RS+PDAC细胞之间的空间限制性交流，交流主要通过PGE2- IL-1β+通路维持。这一相互作用可能有助于解释肿瘤细胞的炎性重编程和病理性程序的获取。

Fig 5

结论

总的来说，本研究发现了PGE2- IL-1β+通路，将其视为肿瘤炎症进展的“驱动器”。炎症重编程和T1RS表达是胰腺肿瘤发生的早期事件，并导致与疾病进展和患者预后不良相关的持续转录变化。IL-1β+TAM和PDAC之间存在正反馈环路，因此可以通过阻断PGE2或IL-1β+活性来打破该促癌环路，从而实现TAMs和胰腺癌细胞的重编程并拮抗肿瘤细胞内外的炎症，从而抑制胰腺癌的炎症和生长，为重新调整免疫动态提供了新的靶点和策略。为胰腺癌的预防和治疗提供了新思路，促进胰腺癌治疗的研究进展。

亮点：
1、研究将单细胞和空间基因组学与功能实验相结合，更好的揭示了胰腺癌中巨噬细胞的功能，解决了IL-1β+ TAMs的分子、空间和功能调控，可以为针对IL-1β+或COX2作为预防性或联合免疫疗法的临床试验的设计和解释提供信息。
2、研究发现了PGE2 - IL - 1β+通路，通过阻断PGE2或IL-1β+活性进行TAM重编程，使胰腺癌免疫动力学重新编程的预防或治疗策略成为可能。