1. CD146 was expressed on a subset of macrophages in the tumor microenvironment
为了确定CD146在肿瘤中的表达情况，作者首先在人和小鼠肿瘤组织中检测了TAM中CD146的表达。
Fig 1A-B： 小鼠肝脏肿瘤中CD146和髓系marker CD11b共定位，流式结果显示CD146在约40%的CD11b+F4/80+巨噬细胞表达。
Fig 1C-D： 随后作者在人的肝癌样本中进行了检测。作者取了肝癌组织，癌旁组织和正常组织，检测了CD146的表达。作者发现CD68巨噬细胞在正常和癌旁组织中均匀分布，在肿瘤组织中则主要around the stroma。表达CD146的巨噬细胞则主要存在于肿瘤组织和癌旁组织之间的tumor margins。
Fig 1E-G：流式结果也显示CD146巨噬细胞在癌旁组织中最多。
2. CD146 expression on macrophages was controlled by STAT3 signaling in the tumor microenvironment
由于前面发现肿瘤内CD147巨噬下降，作者想要去探究原因。
Fig 2A-C： 作者发现巨噬细胞在TCM刺激早期(24–48 h)上调，但是在更长时间的刺激下下调(72–96h)。此外，短期刺激时M1的marker如iNos, Tnfa, Il1b, Il6出现上调，长期刺激M2的marker Arg1, Ym1, Il10, Mgl1则出现上调（附件）。
这个现象跟肿瘤内CD147巨噬下降一致。
TCM是tumor cell-conditioned medium，是模拟肿瘤生长微环境的培养基
Fig 2D： 为了确定是什么信号通路调控者CD146的表达，作者对TCM- stimulated 和 non–TCM-stimulated巨噬细胞进行了蛋白组检测，得到128个上调蛋白和82个下调蛋白。（这个log2FC阈值卡的好宽松，看起来是0.25）
Fig 2E： 随后作者做了转录因子富集分析，发现有25个转录因子调控差异蛋白的表达。（这不是找到了25个，而是展示了top25吧）
这个图是用
ChIP-X Enrichment Analysis (ChEA3)做的
在作者团队此前的研究中，作者发现STAT3信号通路促进 M2-like 极化，伴随着CD146的下调，因此作者主要关注了STAT3。
Fig 2F： TCM刺激20min后，巨噬细胞STAT3的磷酸化显著上调。
Fig 2G： 而且STAT3的活化随着TCM刺激时间而增加。
Fig 2H-I： 在使用了STAT3抑制剂之后，作者发现CD146的表达显著上调。
TF knockdown analysis (http://www.licpathway.net/KnockTF/analysis) indicated that CD146 was negatively regulated by STAT3 (Fig. S1I).
3. CD146 expression on macrophages inhibited tumor development
Fig 3A： 为了明确CD146+巨噬在肿瘤生长中的作用，作者首先分析了CD146+巨噬细胞比例和HCC病人生存率之间的关系。结果显示CD146+巨噬细胞比例越高，患者存活期越长。
Fig 3B： 随后作者构建了巨噬细胞CD146条件性敲除小鼠，构建了肝癌和结直肠癌模型。发现CD146敲除鼠的两种肿瘤都生长的更快。
Fig 3C-E： 在diethylnitrosamine (DEN)诱导的原位肝细胞癌模型中，和对照相比，巨噬细胞CD146敲除鼠的肿瘤发生率和surface tumor都更多。
Fig 3F-G： KO鼠肿瘤中的血管也更多，髓系细胞比例增加，T细胞比例相对减少。此外DC和NK细胞比例也减少，CD11b+Gr-1+ MDSCs和Treg增加。
Fig 3H-J： 为了确定增加的CD146+巨噬细胞和antitumor activity之间的关系，作者使用对照和CD146的质粒转染RAW，和肝癌细胞（1:2）一起输给小鼠，发现输入过表达质粒的小鼠肿瘤体积显著更小。
匪夷所思的操作增加了...哪怕用BMDM呢，也比直接回输细胞系强啊
Fig 3K：作者还用了嵌合小鼠模型，将CD45.1+ (WT) donors的骨髓和CD146 M-WT (CD45.2+CD45.1–， mixed WT-WT)或CD146 M-KO (CD45.2+CD45.1–，mixed KO-WT)的骨髓1:1混合，移植给了CD45.1+ host mice or M-WT or M-KO host mice。6周后嵌合小鼠被用于构建皮下移植肿瘤模型或原位肝肿瘤移植模型。
Fig 3L-N： 和移植WT-WT小鼠相比，移植KO-WT骨髓的小鼠肿瘤更大。
4. The antitumor effect of CD146+ macrophages was partially dependent on T cells
巨噬细胞在肿瘤生长中的作用有很多决定因素，如调节肿瘤血管生成、调节其他免疫细胞或直接影响肿瘤细胞。
Fig 4A-D： WT和CD146KO的巨噬在吞噬能力上没有差别
Fig 4E-F：在增殖能力上也没有差别
These data suggested that CD146 was not directly involved in the function of macrophages in tumor phagocytosis or proliferation.
由于肿瘤细胞的eradication主要依赖于T细胞，作者随后探究了巨噬 CD146介导的肿瘤细胞生长抑制是否是T细胞依赖的。
Fig 4G-H：作者将CD146 WT 或 KO 巨噬和肿瘤细胞2:1混合，腹腔注射给了WT和Rag1 KO (T细胞缺陷鼠)。结果显示注射KO细胞给WT鼠，其肿瘤大小比注射WT细胞给WT鼠显著要大，但注射给Rag1 KO鼠其肿瘤大小则没有明显差异。
这些结果提示CD146巨噬介导的肿瘤大小抑制主要依赖于T细胞。
5. CD146 deletion on macrophages promoted the recruitment of CD11b+Gr-1+ MDSCs
由于M-KO存在抑制性肿瘤免疫微环境，而MDSC是重要的免疫抑制细胞，作者推测 M-KO 巨噬可能与MDSCs的招募有关。
Fig 5A-C： 作者将Hepa1-6细胞和 M-WT 或 M-KO 鼠巨噬混合，腹腔注射给了enhanced green fluorescent protein (EGFP)-transgenic mice。同样的，注射M-KO 鼠巨噬的鼠肿瘤大小显著要小。
Fig 5D-E： 随后作者分离了肿瘤浸润的EGFP+白细胞，发现注射了M-KO 鼠巨噬的小鼠CD11b+ Gr-1+ MDSCs (approximately 50%) 显著增多，尤其是 Ly6G+ G-MDSCs，而肿瘤浸润CD4+和CD8+ T 细胞则显著更低。
Fig 5F-H： 在另一个EL4肿瘤模型中也得到了一致的结论。
Fig 5I： 为了确定CD146-KO巨噬细胞对MDSC的招募作用，作者设计了体外细胞迁移实验。下层铺的是M-WT或M-CD146 KO，上层底下铺了一层内皮，然后加了从EL4肿瘤鼠中分离的CD11b+Gr-1+ MDSCs。
Fig 5J： 结果显示CD146 KO的巨噬招募了更多的MDSC
这个实验倒是很好理解 但是这是怎么做的检测呢？把下室的细胞做荧光/消下来做流式？
Fig 5K-L： 为了探究是哪种细胞因子/趋化因子促进了M-KO鼠中MDSC的招募，作者使用Luminex检测了36个细胞因子/趋化因子，又在mRNA水平做了检测，并检测了TCM不同刺激时间的表达情况，发现多种趋化因子表达增加。
Fig 5M： 抑制了CCR5后趋化下降
6. CD146-deleted macrophages promoted the recruitment of MDSCs via JNK signaling
Fig 6A： 为了探究CD146调控细胞因子上调的机制，作者对M-KO macrophages和 M-WT macrophages进行了蛋白组检测，鉴定出26个上调蛋白和21个下调蛋白。(都没打过转录组，上来都是蛋白组，真有钱啊)
Fig 6B： 预测了调控这些蛋白的转录因子，发现JUN是其中最重要的TF，提示JNK信号通路可能在M-KO macrophages中起到比较重要的作用。
Fig 6C-D： 为了验证前面的假设，作者使用TCM刺激了M-KO macrophages和 M-WT macrophages，检测了JNK信号通路的分子。发现敲除CD146后，通路激活更强。提示CD146 negatively controlled JNK signaling in macrophages。
为了确定M-KO macrophages促进MDSC招募是通过JNK信号通路，作者检测了给或不给JNK抑制剂时TCM刺激下M-WT 和 M-KO巨噬的趋化因子表达情况。
Fig 6E-F： 发给给了抑制剂后趋化因子表达显著下降。
7. CD146 positively regulated NLRP3 inflammasome activation by JNK signaling
We next explored how to enhance the antitumor activity of TAMs.
在Fig 6A中，上调的FC最大的蛋白是Tmem176b
Fig 7A： 分选normal, peritumor 和 intratumor 组织中CD11b+CD14+CD163+巨噬的转录组，作者发现MCAM的在正常组织中表达高，在癌旁组织和肿瘤内部表达低，TMEM176B则相反。此前有报道提示myeloid TMEM176B是肿瘤免疫治疗的potential modulator，因此作者推测TMEM176B受MCAM的负性调控，并调节肿瘤生长。
Fig 7B： 在TCM的刺激下，M-KO 细胞或 CD146- KO Raw264.7细胞的TMEM176B表达显著比对照要高。
Fig 7C：MCAM对TMEM176B的负性调控受JUN调控
此前有文献报道TMEM176B参与移植Caspase-1的活化和IL-1β的成熟（Caspase-1和IL-1β都是inflammasome活化的标志），基于MCAM对TMEM176B的负性调控关系，作者推测CD146参与炎症小体的活化。
Fig 7D： 结果显示TCM刺激24h后CD146-deleted macrophages Il1b的表达显著比M-WT细胞要高。
Fig 7E： TCM刺激的M-WT和M-KO的western证实了CD146-deleted macrophages炎症小体活化下降。
Fig 7F-G： TMEM176B inhibito增加了M-KO鼠的Caspase-1 activation and IL-1β maturation。
8. CD146 deletion-induced MDSC recruitment partially depends on TMEM176B
Fig 8A： 为了确定CD146 巨噬细胞的抗肿瘤效果是依赖于TMEM176B还是趋化因子，或是两者的共同作用，作者使用ELISA检测了TMEM176B inhibition后的趋化因子水平。结果显示TMEM176B inhibition降低了CCL2, -3, -4的表达，对CXCL2和CXCL5则没有影响。
Fig 8B： TMEM176B inhibitor Bayk8644 partially blocked M-KO- induced MDSC transmigration in vitro
这些结果提示TMEM176参与调控M-KO macrophages中一些趋化因子的表达。
作者同样检测了趋化因子的表达是否影响TMEM176。
Fig 8C： 使用chemokine inhibitor bindarit 对M-KO macrophages中TMEM176的表达没有影响。
这些结果提示巨噬细胞中的CD146 deletion 上调了TMEM176B 和一些趋化因子如 CXCL2 和 CXCL5的表达，而 TMEM176B的表达本身也可以促进一些趋化因子的表达上调如CCL2, CCL3 和 CCL4, 引起 MDSC 迁移增加。
为了探究CD146巨噬在体内调控肿瘤细胞生长是通过TMEM176B，作者在M-WT和M-KO鼠构建了肿瘤模型，并使用了BayK8644治疗。
Fig 8D-E： 结果显示在M-WT小鼠，BayK8644治疗抑制了约35%的肿瘤生长，在M-KO鼠中抑制了约55%。
Fig 8F： 流式分析也提示BayK8644-treated M-KO mice存在更少的MDSCs肿瘤内浸润，T细胞则轻度增高。
These data suggested that tumor promotion in M-KO mice at least partially depends on TMEM176B expression.
看完的感觉：工作量好大
查了一下 作者是专门研究CD146的
值得学习的点：
- 蛋白组数据+转录因子预测（
ChEA3/KnockTF） - 体外给巨噬细胞过表达靶分子+回输 （尤其适用于不好直接体外给药阻断的胞内分子）
- 看分子A/细胞A介导的效应是否是另一种分子B/细胞B依赖的：给分子B/细胞B缺陷鼠过表达/回输分子A/细胞A。
- 看一种细胞对另一种细胞的趋化（Fig 5I-J）+ 趋化效应是什么介导的（Fig 5K-M）
