德运康瑞创始人兼首席科学家杨朝勇教授课题组自主创新开发出一款“自降噪”的高通量单细胞测序技术Well-paired-seq，于2022年5月份发表在 Small Methods杂志（影响因子14.80） 。该技术基于一种双层微孔芯片，可以实现细胞和编码微球高效精准的1:1“配对”，突破泊松分布原理限制，利用准静态流体力学原理有效清洗背景杂质， 实现了优异的细胞捕获效率、细胞/微球配对效率和细胞游离RNA去除效率。基于Well-paired-seq，单张芯片上可以实现通量10万级的高通量单细胞RNA测序，并且在单细胞多组学应用拓展方面有极大潜力。
背景
近几年 scRNA-seq 技术高速发展，以前所未有的分辨率揭示了细胞组成和功能状态的异质性，已广泛应用在免疫学、神经生物学、癌症基因调控和表观遗传学的研究。但现有的高通量单细胞测序平台还存在一定局限性，如：
基于液滴的方法：依赖泊松分布实现单细胞-单微球配对，存在大量空液滴不可利用，导致试剂浪费和细胞损失；
基于微孔的策略：如 Seq-well 和 Microwell-Seq，利用细胞重力沉降进而捕获，无需精密设备，但同样存在有限稀释导致的微孔利用率低的问题；此外，由于该平台为开放体系，细胞裂解后，微孔间 mRNA 容易发生交叉污染；在组织解离过程中常常也会由于细胞破裂，产生游离的 mRNA，导致背景干扰，掩盖细胞之间真正的异质性。
技术原理
为应对以上挑战，我们开发了一种高通量、高利用率、低成本的单细胞测序新方法Well-paired-seq（图1），该方法协同尺寸排阻和局部准静态流体动力学原理设计了含数万到数十万个双层微孔的配对芯片，上下层微孔尺寸分别符合编码微球和细胞大小。由于尺寸排阻的作用，每层微孔只能进行单颗粒的沉降捕获，从而实现细胞与微球的1:1配对。相对于最上层的流体通道，微孔中流速骤降，最下层的细胞捕获孔可达到准静态，这保证了已捕获的细胞不会因上层流体的扰动而损失；通过多次沉降可实现细胞累积捕获，提高细胞利用率和与微球的配对效率。此外，我们提出了矿物油封闭裂解的新方法，为细胞裂解创造封闭环境，避免孔间 mRNA 交叉污染。操作流程如下1、首先依次捕获细胞和微球，使其1:1配对；2、然后通入含表面活性剂颗粒的矿物油封闭上层微孔，表面活性剂沉降并溶于微孔中的缓冲液，从而裂解细胞；3、释放的 mRNA 被微球捕获，回收微球后进行逆转录、cDNA 扩增及后续的建库测序，通过识别细胞和分子编码得到高至 100, 000 个单细胞的基因表达谱。
芯片结构特点
Well-paired-seq 芯片（图2a）由上万个双层微孔组成（图2b、c），上下两层分别被设计为单个微球和细胞的捕获孔，微球捕获孔设计为内切圆直径和高度均为 50µm 的六棱柱型，细胞捕获孔长宽高均为 25µm。通过软件模拟流体行为（图2d），在 0.45 m/s 的速率下，其下方的细胞捕获孔实现了流体速率最大程度的下降，可视为准静态（图2e）。因此，当在流动通道中引入较大的流体扰动时，最下层的细胞捕获孔扰动极小，从而实现在不影响已捕获细胞的情况下，去除微球捕获孔中多余细胞。还可以进行多次沉降捕获，产生累积捕获效应，提高细胞与微球配对效率。
芯片性能测试
1、高效的细胞捕获在芯片中加载细胞和微球，微孔的占有率分别能达到 83%（细胞）和 99%（微球），配对率约为 82%（图3a、b），相较于其他基于微孔的平台，本平台的配对率增加了 8 倍。此外，在不同细胞投入量下，通过三次累积捕获均可达到 90% 左右的细胞捕获率（图3c，显微镜下观察计数）。
2、密封微孔避免交叉污染在芯片中通入荧光染料并用矿物油覆盖（图3d），与双孔处荧光强度形成鲜明对比，孔间位置的荧光无检出（图3e），表明矿物油有效的密封了微孔。将 Calcein AM 染色的细胞加入微孔，可以观察到细胞裂解物的荧光被限制在双孔中，表明通过矿物油密封可高效地裂解细胞并避免交叉污染。
3、有效去除游离RNA背景从人或小鼠细胞中提取 RNA与另一物种的细胞混合，细胞被捕获至芯片后用缓冲液清洗去除游离 RNA 并进行后续操作，测序结果表明没有检测到来自其他物种的游离 RNA（图3f，g），表明 Well-paired-seq 芯片具有优秀的游离 RNA 去除能力。此外，清洗可以轻松去除细胞悬液样品中的团聚细胞和碎片杂质，有利于进一步提高数据质量（图3h，i）。
4、双胞率低且捕获无偏倚人细胞和小鼠细胞按 1：1数量比例混合上样到芯片中，最终分析得到 2,810 个人细胞和 2,254 个小鼠细胞（图4a，b），测序结果展示的多胞率低于 3.5%（图4c），细胞回收率约为 65% （图4d）。将小鼠细胞按1：300 的比例添加到人类细胞中，测序结果显示两物种细胞捕获比例与预期相符(1：350)（图4I），表明Well-paired-seq 平台可实现对稀有单细胞的无偏倚检测。
以上数据表明，Well-paired-seq 微孔利用率和细胞-微球配对率高，具有强大的游离 RNA 和细胞团去除能力，减少了下游数据分析的技术差异和背景噪音干扰；该平台具备高通量细胞捕获性能的同时有效控制双胞率，可以实现各种细胞类型的无偏倚捕获。
“复杂细胞组成”的样本测试分析
为考察 Well-paired-seq 对复杂细胞种类组成的样本类型的解析能力，我们测试了 5 种人肺腺癌细胞系组成的混合样品，5 种细胞类型明显分为5个细胞群， 并且可以通过细胞特征基因的表达水平进行标记和区分（图5a，b），并且两次重复实验中的各细胞占比与上样细胞比例保持一致（图5c）。
该平台进一步用于外周血单个核细胞（PBMCs）的分析，对两名健康人的 PBMCs（合计8027 个细胞）进行单细胞转录组测序，聚类并注释后得到7个细胞群（图5d），含 33.4%的 CD4+T细胞，15.8%的 CD8+T细胞，23.5%的 NK细胞，8.0% 的 B细胞，13.1% 的 CD14+单核细胞，4.3% 的 FCGR3A+单核细胞和 1.9%的树突状细胞。以上数据表明Well-paired-seq 在复杂样本中的细胞类型解析和异质性分析方面性能优异。
总结
Well-paired-seq单细胞测序技术基于双孔芯片的创新设计，在细胞捕获、细胞/微球配对、游离 mRNA 去除等方面具有出色的效率，显著地降低了细胞的损失和背景噪音，以较低的双胞率实现了高通量单细胞测序分析。此外，我们提出的矿物油封闭裂解策略有效避免了微孔间的交叉污染。利用该技术平台，我们全面分析了人 PBMCs 和药物处理细胞等样本的细胞组成和异质性特征。
目前，德运康瑞正在基于Well-paired-seq技术开发产品和商业落地，进一步提升该技术的综合性能，致力于打造一款高效捕获、自降噪、高保真的高通量单细胞组学平台，为单细胞测序技术推向精准医学应用奉献中国创新智慧。
原文链接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smtd.202200341
