引言

从肿瘤微环境中筛选出一个全新分泌蛋白，它能显著抑制癌细胞增殖。然而当开发靶向药物时，却卡在最关键的一步 —— 找不到它在细胞膜上的受体。这并非个案：人类基因组中超过30%的分泌蛋白仍是"孤儿配体"，而质膜上约20%的受体也找不到配体，成为"孤儿受体"。这种"信号分子找不到门，门锁找不到钥匙"的困境，是细胞通讯研究的核心挑战。

为何寻"门"如此艰难？受体与配体的结合是低丰度、弱亲和力、瞬时性的"分子握手"，传统生化手段难以捕获。

通过调研，丸子发现前沿研究已演化出两条核心技术路线：一是"先纯化后修饰"的化学偶联标记法，将分泌蛋白改造为带"信标"的分子探针，原位捕获受体；二是"基因融合表达"的酶标记法，通过构建融合蛋白实现表达克隆与功能筛选。

本期我们就先深入拆解第一条路线，系统揭示如何将分泌蛋白转化为"精准探针"，从活细胞表面"钓"出隐匿的受体。

策略核心逻辑：把普通配体变成“精准探针”

化学偶联标记法的核心思路源于经典生物化学思维：

先在体外获得高活性、高纯度的重组分泌蛋白（配体），再通过化学交联技术，将酶（如辣根过氧化物酶HRP）或特异性捕获探针共价连接到配体上，让配体兼具“结合受体”和“信号放大/捕获”双重功能。

整个实验流程可概括为三步：

1. 蛋白获取：构建表达载体，在哺乳动物细胞（如HEK293、CHO）中表达并纯化目的分泌蛋白；

2. 化学修饰：用双功能交联剂，将标记酶或捕获探针偶联至纯化配体；

3. 细胞结合与检测：将修饰后的配体与靶细胞孵育，通过酶催化反应显色/荧光检测，或结合质谱鉴定受体。

第一步：蛋白纯化 —— 纯度与活性是成功的基石

想要后续偶联顺利，获得高活性、高纯度的重组配体是首要前提，这绝非简单的“表达-纯化”流程，而是关乎构象维持的系统工程。

1. 表达系统：真核细胞是唯一选择

为什么不选成本低、产量高的大肠杆菌？关键在于分泌蛋白的结构需求：

▶ 二硫键形成：分泌蛋白常依赖二硫键维持稳定性，大肠杆菌细胞质是还原环境，难以形成二硫键，易产生无活性的包涵体；

▶ 糖基化修饰：受体识别往往依赖配体特定的糖型，原核生物无糖基化机制，昆虫细胞糖型简单，只有哺乳动物细胞（HEK293、CHO）能提供最接近天然的修饰，保证配体与受体的结合活性。

2. 纯度要求与缓冲液限制

▶ 纯度标准：用于偶联的蛋白纯度需≥95%。若存在血清白蛋白等杂质，交联剂会无差别标记，导致细胞结合时出现高背景噪音，产生假阳性；

▶ 缓冲液禁忌：若使用基于胺基反应的交联剂（如NHS-ester），缓冲液中不能含Tris、Glycine或叠氮钠，需通过透析或脱盐柱置换为PBS、HEPES等缓冲液；

▶ pH控制：胺基与NHS-ester的反应在pH：7.2-8.5最有效，pH过低会降低反应性，过高则加速试剂水解。

第二步：化学修饰 —— 在活性和标记之间找平衡

将HRP这样的大分子酶偶联到配体上，就像给精密仪器挂“铁锚”，稍不注意就会破坏配体的受体结合位点。如何兼顾标记效率与蛋白活性，是这一步的关键。

1. 选对标记酶：优先HRP

在化学偶联法中，辣根过氧化物酶（HRP）远比碱性磷酸酶（AP）常用，核心优势有三点：

▶ 结构紧凑：分子量仅44kDa，空间位阻远小于二聚体形式的AP（~140kDa）；

▶ 修饰友好：表面赖氨酸残基分布合理，且自身为糖蛋白，可通过氧化糖链定向偶联，减少对酶活性的影响；

▶ 催化高效：转化数极高，能快速催化底物实现信号级联放大，提升检测灵敏度。

2. 三种偶联方法（按优先级排序）

▶ 方法一：糖基氧化策略（推荐，定向偶联）

适合糖蛋白配体：用高碘酸钠（NaIO4）温和氧化配体糖链，生成醛基，再与HRP上的胺基/肼基形成稳定键。优势是糖链通常远离受体结合位点，能最大程度保留活性。

▶ 方法二：胺基反应策略（通用）

用异双功能交联剂（如Sulfo-SMCC）连接配体的赖氨酸侧链或N端氨基与HRP的巯基。操作简单，但赖氨酸可能位于结合位点，有“随机致残”风险。

▶ 活性验证：竞争性结合实验是“试金石”

无论采用哪种偶联方式，都必须通过竞争性抑制实验验证探针特异性：孵育标记配体（如HRP-配体）时，加入10-100倍过量的未标记“冷”配体。若信号显著抑制，说明标记配体通过特异性位点结合；若信号无变化，则是标记导致的非特异性粘附，探针无效。

▶ 控制偶联比（DOL）

每个配体分子偶联 1-3 个 HRP/Biotin 最佳：标记过度会导致蛋白沉淀或失活，标记不足则信号太弱。

▶ 注意事项

偶联后必须淬灭：加入过量Glycine或Tris中和未反应的交联剂，防止后续孵育时非特异性交联细胞表面蛋白；

全程冰上操作，避免高温导致配体或 HRP 失活。

第三步：进阶筛选 —— 从“检测结合”到“鉴定未知受体”

如果只是想验证已知受体，用标记配体做原位染色即可；如果要从头发现未知受体，推荐两种高灵敏度技术：

LRC-TriCEPS（配体 - 受体捕获技术）—— 锁定瞬时互作

适合从头鉴定未知受体，核心是“共价锁定”弱相互作用，流程如下：

1. 配体偶联：在pH 8.2 的HEPES缓冲液中，将TriCEPS探针与300μg左右纯化配体偶联（用Dot Blot验证偶联效率）；

2. 细胞表面氧化：4℃下用1.5 mM NaIO4处理10^8个靶细胞15分钟（温和氧化受体糖链，产生醛基，不破坏细胞膜）；

3. 受体捕获：将TriCEPS - 配体加入细胞（pH 6.5-7.4），配体结合受体后，TriCEPS的肼基与受体醛基形成稳定键（把瞬时结合变成共价连接）；

4. 酶解与富集：裂解细胞，胰蛋白酶消化，用链霉亲和素珠子富集带生物素的受体肽段；

5. 质谱分析：对比实验组和对照组，高富集倍数且高显著性的糖基化膜蛋白就是候选受体。

【优势】

无需遗传操作，可用于原代细胞、组织切片；共价交联解决了瞬时互作的洗涤流失问题；

【注意事项】

▶ 配体需求量大（毫克级），难表达配体需提前评估产量；

▶ 必须设置阴性对照，否则无法排除非特异性结合的假阳性；

▶ 细胞氧化步骤要严格控制温度和浓度，避免细胞死亡。

HRP-SPPLAT（邻近标记技术）—— 检测极低丰度受体

核心是“信号放大”，适合受体丰度极低的情况，流程如下：

1. 探针结合：将 HRP 偶联的配体与活细胞表面受体结合；

2. 脉冲标记：加入生物素 - 酪胺和 H2O2，反应 1-10 分钟（HRP 催化生成短寿命自由基，仅标记 20nm 内的受体及邻近蛋白）；

3. 猝灭与富集：加入抗坏血酸钠终止反应，裂解细胞后用链霉亲和素珠子富集生物素化蛋白，质谱鉴定。

【优势】

信号放大效应显著，能检测极低丰度受体；

【注意事项】

▶ 标记时间不能过长（≤10 分钟），否则会标记无关蛋白，背景升高；

▶ 需用空间滤除算法和阴性对照排除非受体的邻近蛋白。

核心避坑总结

1. 控制偶联比（DOL）：每个蛋白分子偶联1-3个HRP/生物素为宜，标记过度导致蛋白沉淀/失活，标记不足则信号微弱；

2. 彻底淬灭反应：偶联后加入过量Glycine或Tris中和未反应的交联剂，避免非特异性交联细胞表面蛋白；

3. 设置严格对照：TriCEPS实验需设置“配体-Glycine”或“配体-Transferrin”对照，仅富集倍数高且显著的糖蛋白才是候选受体。

结语

基于体外纯化蛋白的化学偶联标记法，凭借其无需遗传操作、可原位捕获瞬时互作的优势，成为难表达配体（如复杂毒素、病毒颗粒）的受体鉴定首选。从经典的HRP偶联到现代的TriCEPS/SPPLAT技术，这条路线不断在灵敏度和特异性之间突破平衡。

但如果你的配体易于在哺乳动物细胞中表达，且希望通过更简洁的方式验证受体，甚至克隆受体基因，那么另一条核心路线 —— 基于基因融合表达的酶标记法，会更适合你。

下一期，我们将详细拆解这一“金标准”策略，看看如何通过基因工程构建融合探针，利用表达克隆技术“地毯式”筛选受体。敬请期待！

参考文献

1. Liu Q, Zheng J, Sun W, et al. A proximity-tagging system to identify membrane protein-protein interactions. Nat Methods. 2018;15(9):715-722. doi:10.1038/s41592-018-0100-5

2. Krug AW, Pojoga LH, Williams GH, Adler GK. Cell membrane-associated mineralocorticoid receptors? New evidence. Hypertension. 2011;57(6):1019-1025. doi:10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.159459

3. Chen J, Fang M, Li Y, et al. Cell surface protein-protein interaction profiling for biological network analysis and novel target discovery. Life Med. 2024;3(4):lnae031. Published 2024 Aug 29. doi:10.1093/lifemedi/lnae031

4. Bagheri Y, Ali AA, You M. Current Methods for Detecting Cell Membrane Transient Interactions. Front Chem. 2020;8:603259. Published 2020 Dec 7. doi:10.3389/fchem.2020.603259

5. de Jong E, Kocer A. Current Methods for Identifying Plasma Membrane Proteins as Cancer Biomarkers. Membranes (Basel). 2023;13(4):409. Published 2023 Apr 5. doi:10.3390/membranes13040409

6. Abbineni PS, Tang VT, da Veiga Leprevost F, et al. Identification of secreted proteins by comparison of protein abundance in conditioned media and cell lysates. Anal Biochem. 2022;655:114846. doi:10.1016/j.ab.2022.114846