杂志：2022年1月《MABS》
题目：计算预测治疗性抗体的 PTMs
单位： 新加坡龙沙（Lonza）生物制剂开发部
1 摘要
1、单克隆抗体在生产、储存和运输过程中易受化学和酶促修饰的影响。脱酰胺、异构化和氧化会损害治疗性抗体的效力、功效和安全性
2、本文综述了用于预测 脱酰胺、异构化、氧化、糖基化、羰基化、硫酸化和羟基化 的计算方法
2 介绍
1、物理和化学不稳定性会对治疗性抗体的可制造性、安全性和功效产生负面影响。与所有蛋白质一样，mAb 易受化学降解（例如氧化）的影响。以及细胞培养过程中的酶促修饰（例如硫酸化）。化学和酶促修饰会导致异质性。例如，天冬酰胺 (Asn) 脱酰胺可产生电荷变体；色氨酸 (Trp) 氧化可产生亲水或疏水变体
2、识别 PTMs 的实验方法（肽图分析、阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱等色谱等）非常耗时，并且需要大量纯化的蛋白质，计算工具因其成本低、样品消耗少、速度快等特点，在可开发性评估中正变得越来越普遍。在过去十年中，计算工具已被用于预测翻译后修饰（PTM）易感位点，并设计出化学稳定性更高的抗体
3、移除易感位点并非总是可行的，尤其是在氨基酸残基参与抗原结合的情况下。IgG-抗原复合物的互补位预测和分子对接可以指导抗体工程的可开发性
3 预测 PTM 的计算方法
1、预测翻译后修饰 (PTM) 的计算方法可分为三类：基于序列的、基于结构的和基于物理的。基于序列的方法要么标记易发生化学降解的残基（例如，甲硫氨酸氧化），要么标记易发生脱酰胺的基序（例如，脱酰胺的 NG、NS 和 NT）；基于结构的方法通过使用与酶和化学修饰相关的结构特征来预测 PTM 信息。常见的结构特征包括但不限于二级结构、水配位数 (WCN) 和溶剂可及表面积 (SASA)；基于物理的方法基于物理原理：例如，分子动力学 (MD) 模拟使用牛顿物理学来预测原子随时间的空间位置
2、基于序列的方法简单易行。一旦获得蛋白质序列，就可以通过检查易受影响的基序来排除化学稳定性较差的候选蛋白质。然而，单独使用易降解基序可能会高估易降解残基的数量，或者错过潜在的降解热点。模型肽的化学降解率并不代表天然蛋白质的化学降解，其中三级结构在化学和酶促修饰中发挥作用。例如，高溶剂暴露会增加化学改性的风险，因为会增加对水、过氧化物和光等降解剂的暴露
3、基于结构的方法比基于序列的方法具有更好的准确性，因为计算机预测包括二级和三级结构对 PTM 的影响。基于结构的方法的准确性取决于晶体或预测结构的质量以及结构特征的选择。了解修饰（例如脱酰胺）的化学机制可以提高基于结构和物理方法的准确性
4、基于物理的方法能够为化学降解的动力学和能量学提供宝贵的见解，但与基于序列和结构的方法相比，基于物理的方法对计算的要求更高。预测自由能垒并对抗体等较大蛋白质进行分子动力学模拟既具有挑战性，又耗时
4 天冬氨酸异构化
1、mAb 中的天冬氨酸 (Asp) 残基可以发生异构化，形成异天冬氨酸 (IsoAsp)。isoAsp 的羧基会连接到主链的 β-碳上（而不是α-碳），这会造成主链断裂或扭曲
2、基于序列的方法：基于序列的预测 Asp 异构化方法标记了易发生 Asp 异构化的基序，例如 DG、DS、DD、DT 和 DH。侧翼甘氨酸 (Gly) 残基由于空间位阻较低，更有利于 琥珀酰亚胺（Succinimide） 的形成。丝氨酸和苏氨酸残基可以在异构化过程中充当质子供体。n + 1 或 n-1 位带正电荷的残基可因静电效应加速 Asp 异构化。此外，作为质子供体和受体的侧翼残基可以使Asp残基更具反应性，更容易异构化。例如，在琥珀酰亚胺形成过程中，组氨酸残基可以在低pH值下充当质子供体。 在可开发性阶段，可以利用蛋白质工程来消除 PTM 责任并提高化学稳定性。可以用不易异构化的谷氨酸取代天冬氨酸降低异构化风险。例如，Patel 等人在 CDR loop 区发现了一个易发生异构化的 DS 基序：用谷氨酸取代天冬氨酸会导致生物活性丧失。然而，对 n + 1 位残基（即丝氨酸）进行改造，既保留了生物活性，又降低了天冬氨酸异构化的风险
3、基于结构的方法：抗体的高级结构也对Asp异构化的风险起着至关重要的作用。Diepold 及其同事观察到，在溶剂暴露且灵活的 CDR loop 区内，易结合基序发生了异构化。然而，在抗体保守区的 DG 基序上并未发生异构化。基于结构的预测 Asp 异构化的方法包括溶剂暴露、二级结构、亲核攻击（Cγ – N n+1）距离和氢键
4、基于物理的方法：MD模拟可以补充基于结构的Asp异构化预测方法
5 天冬酰胺脱酰胺
1、Asn 残基可以脱酰胺形成 Asp 或 IsoAsp。Asn 脱酰胺有三种可能的途径。n + 1 位残基上的骨架氮受到亲核攻击，生成琥珀酰亚胺，琥珀酰亚胺水解后形成 Asp。或者，主链羰基的亲核进攻可以形成异酰亚胺，其水解为IsoAsp和Asp（在酸性pH值（pH≤4）下，Asn直接水解也可以形成Asp。直接水解途径与琥珀酰亚胺介导的脱酰胺作用竞争。如 Fig1 所示
2、基于序列的方法：易于脱酰胺的基序包括 NG、NS、NN、NT 和 NH：NG基序的脱酰胺率最高，其次是NS、NT和NH。NG基序的高脱酰胺率可归因于其形成琥珀酰亚胺时较低的空间位阻。
3、基于结构的方法：更高级的结构也会影响 Asn 脱酰胺的速率。由于结构刚性和广泛的氢键网络，β折叠中的Asn脱酰胺风险较低。基于结构的脱酰胺预测方法包括二级结构、氢键、SASA、二面角和亲核攻击（Cγ – N）距离。Table1 汇总了ASn 脱酰胺机器学习方法参数汇总。
6 氧化
抗体的氧化可能是由于制剂中的过氧化物、生产过程中接触微量金属以及光照造成的。芳香族氨基酸以及蛋氨酸和半胱氨酸残基的硫基团最容易被氧化。基于序列的方法将可变域中的所有 Met 和 Trp 残基标记为易感残基。然而，由于高阶结构对氧化的影响，基于序列的方法可能会高估氧化风险。暴露的蛋氨酸、色氨酸和组氨酸更容易被氧化。SASA 是识别易氧化蛋氨酸和色氨酸残基的常用预测因子
6.1 甲硫氨酸氧化
抗体中的甲硫氨酸氧化会降低构象稳定性，产生亲水变体，引起结构变化，并影响与抗原的结合。CDR loop 区内的 Met 残基比 Framwork 区域的 Met 残基更容易氧化
6.2 色氨酸氧化
色氨酸氧化会因犬尿氨酸的形成而引起颜色变化，降低物理稳定性，CDR loop 区内的色氨酸残基氧化可以降低结合亲和力。结构灵活性、溶剂暴露、二级结构以及侧链和主链构象都会影响色氨酸的氧化。Trp 氧化在溶剂暴露且灵活的 CDR 环中更常见
6.3 组氨酸氧化
在光胁迫或MCO作用下，单线态氧与His的咪唑环发生反应，生成过氧化物中间体，进而生成氧代 His 或交联产物。位于高柔性和溶剂暴露区域的 His 残基更容易氧化
7 赖氨酸糖基化
1、糖化是一种非酶促修饰，其中赖氨酸 (Lys) 和精氨酸残基或 N 端的氨基被葡萄糖等还原糖糖化。希夫碱是由还原糖的醛和赖氨酸残基的胺基发生缩合反应而形成的（Fig3a）。席夫碱的形成是可逆的；然而，多步阿马多里重排可以生成更稳定的酮胺(Fig3b).
2、糖基化的赖氨酸残基可以进一步降解形成晚期糖基化终产物，可引起免疫原性反应。赖氨酸糖基化通常发生在制剂、细胞培养和体内的长期储存过程中。配方中的双糖可以降解形成还原糖，导致储存期间发生糖化。在细胞培养过程中，高葡萄糖浓度可加速赖氨酸糖基化并降低蛋白质产量。赖氨酸糖基化可降低与抗原的亲和力，而且会影响净表面电荷，降低抗体之间的静电排斥来增加蛋白质聚集。强制糖基化用于通过在高温下将 IgG 与高浓度的还原糖（例如葡萄糖）一起孵育来识别易发生糖基化的 Lys 残基
3、易于糖基化的基序包括 KD、KXD、KXK 和 KXE。高溶剂暴露是 Lys 糖化的先决条件，但并非所有暴露的 Lys 残基都会被糖化。
8 羰基化
金属离子可以催化精氨酸、赖氨酸、脯氨酸（Pro）和苏氨酸残基的氧化羰基化。铁和铜等过渡金属可以将氧气转化为超氧自由基阴离子。在制造和储存过程中，接触不锈钢表面和玻璃小瓶中的微量金属可能会导致 mAb 发生羰基化。精氨酸和赖氨酸残基的羰基化会导致正电荷损失，从产生酸性变体。mAb 的氧化羰基化也能增加蛋白质聚集
9 酪氨酸硫酸化
1、酪氨酸硫酸化是一种由酪氨酸蛋白磺基转移酶 (TPST) 催化的酶促修饰。在硫酸化过程中，硫酸基团会连接到酪氨酸残基的羟基上。据报道，一些单克隆抗体和双特异性抗体发生了酪氨酸硫酸化。mAb 在CHO 细胞培养过程中可能发生硫酸化。mAb 中的硫酸化会产生酸性变体，但酪氨酸硫酸化对治疗性抗体的安全性和有效性的影响尚未确定
2、酪氨酸残基两侧为酸性残基的区域也更容易被硫酸化（Fig5a）。
10 羟基化
1、羟基化是一种由羟化酶催化的酶促修饰。羟基化可发生在精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸上，但更常见于脯氨酸和赖氨酸。在胶原蛋白中，共识基序（Xaa-Lys-Gly 或 Xaa-Pro-Gly）上的 Lys 和 Pro 残基的羟基化很常见，羟基化有助于稳定胶原蛋白三螺旋。羟基化位点往往无序、暴露，并富含脯氨酸和甘氨酸残基
11 参考文献
[1] Vatsa S .In silico prediction of post-translational modifications in therapeutic antibodies[J].mAbs, 14(1):2023938[2025-06-23].DOI:10.1080/19420862.2021.2023938.
