1. Author
James E. Crowe Jr美国著名的免疫学家和病毒学家，以其在传染病，尤其是新兴病毒领域的抗体研究和疫苗开发方面的开创性工作而享誉全球。现任美国范德比尔特大学医学院 儿科教授、病理学、微生物学和免疫学教授，范德比尔特疫苗中心（VVC） 主任。James E. Crowe Jr不仅是一位顶尖的科学家，还是一位积极推动科研成果转化的企业家。他是IDBiologics公司的联合创始人，该公司致力于将其实验室发现的人源单克隆抗体开发成临床应用的治疗药物。James E. Crowe Jr的研究核心是理解人体如何产生高效的中和抗体来对抗病毒，并利用这一知识开发新型疗法和疫苗。他的成就主要体现在以下几个方向：
Jr实验室最著名的贡献。他们的研究方法非常高效：从感染后康复或接种疫苗后的个体中快速分离出产生抗体的B细胞，然后克隆出这些抗体并进行大量测试。寨卡病毒（Zika virus）： 他的团队在疫情爆发后极短的时间内，就从康复者体内分离出了强效的中和抗体，为治疗和预防提供了重要的候选药物，并帮助理解了免疫保护机制。除此以外James E. Crowe Jr实验室还分离得到其他病原的强效中和抗体：登革热病毒（Dengue virus）、西尼罗河病毒（West Nile virus）、埃博拉病毒（Ebola virus）、呼吸道合胞病毒（RSV）、诺如病毒（Norovirus）、汉坦病毒（Hantavirus）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）。
James E. Crowe Jr的工作反向推动了疫苗学的发展。通过分析最优质抗体所识别的病毒位点（即抗原表位），可以为理性疫苗设计提供精确的蓝图，指导科学家设计出能更有效激发此类保护性抗体的疫苗。他的研究深入揭示了人体对自然感染和疫苗接种产生抗体反应的规律和差异。James E. Crowe Jr建立了一套世界领先的、快速响应的抗发现平台。这套“从患者到抗体”的流程化技术使其能够在任何一种新发传染病出现时，迅速启动研究，在数月甚至数周内筛选出有治疗潜力的候选抗体，为应对未来的流行病威胁做好了技术储备。
2.Background
2.1 EBV（Epstein-Barr Virus）永生化B淋巴细胞
这是一种经典的体外制备人源单克隆抗体的技术，尤其适用于直接利用人源B细胞生产抗体，避免了鼠源抗体的免疫原性问题。EBV永生化技术的核心在于EB病毒（人类疱疹病毒第四型HHV-4） 能够特异性地感染人类B淋巴细胞，并将其转化为能够无限增殖的淋巴母细胞样细胞系。
其分子生物学原理主要涉及病毒蛋白和基因组的作用：1.病毒靶向性：EBV通过其病毒糖蛋白gp350与B细胞表面的CD21分子（也是补体C3d的受体） 结合，从而特异性地感染B细胞。2. 永生化（转化）的关键：病毒进入细胞后，其环形DNA基因组（称为附加体Episome）会留在细胞核内，但并不整合到宿主染色体上。病毒会表达一组特定的潜伏期基因，其中最关键的是潜伏膜蛋白1（LMP1） 和核抗原（EBNA2， EBNA1等）。LMP1： 模拟B细胞激活因子CD40的组成型激活信号，持续提供B细胞增殖和存活信号，抑制细胞凋亡。EBNA2： 作为转录激活因子，上调宿主细胞和病毒自身多种促增殖基因（如c-Myc）和抗凋亡基因的表达。这些病毒蛋白共同作用，劫持了B细胞的正常调控通路，使其摆脱衰老和凋亡的命运，获得永生性（Immortalization），能够在体外持续分裂和培养。3. 抗体的产生：被EBV转化的B细胞保留了其作为B细胞的核心功能，即分泌免疫球蛋白（抗体）。如果一个B细胞在被病毒感染前，已经因为某种抗原刺激而分化为分泌特定抗体的浆母细胞/浆细胞，那么它被永生化后，就会持续分泌同一种特异性抗体，从而建立起一个分泌单克隆抗体的细胞系。
3. Methods
1. 杂交瘤技术与抗体纯化
2. B细胞分析
3. HA蛋白纯化表达
4. 抗体序列测序
5. 中和实验
6. BLI竞争实验
7. 晶体X射线衍射技术
8. 动物实验
4. Results
实验团队将接种A/shanghai/02/2013疫苗的75名受试者作为研究队列，采集外周血后利用EBV技术得到对应抗体进行功能验证。在75名受试者中27名显示出对H7 HA的结合，2名受试者的频率远高于其他人——0.33％和0.75％。值得注意的是，在疫苗接种之前，H7反应性B细胞频率最高的供体H7反应B细胞频率为0.75％H7反应B细胞，但疫苗接种后仅有0.66％。选择了五个代表性受试者来筛选针对Group1和Group2的HA的反应性。分别是185、190、198、208、233号。最常见的交叉结合模式是H7-H3交叉反应性。对于185、190和233号来说，它们最常见的B细胞反应性是H3。 其他2个受试者（198和208）对H1具有最常见的B细胞反应性。 因此，尽管是H7疫苗接种者，但都表现出H1或H3反应性。
实验团队从12个受试者中挑选了20个mAb，11个的EC50值低于1μg/ml。H7.57，H7.169和H7.134均在ng/mL范围内显示出EC50值。在12个mAb中，浓度低于2μg/ml的HAI活性。所有5个具有HAI活性的mAb均具有对A/02/2013 H7N9疫苗菌株的活性，H7.167表现出特别有效的抑制作用，具有半最大的抑制浓度（IC50）为31 ng/ml。 所有5个具有HAI活性的mAb也抑制了对欧亚谱系H7N9和H7N3病毒以及北美H7N3病毒的活性。H7.96抗体表现出A/Sydney/5/1997（H3N2）的有效中和活性，即使它没有针对H7的 HAI活性——这表明它可能是从先前H3暴露引起的记忆B细胞中得出的。
紧接着实验团队检测了11株抗体的交叉反应性。其中5个抗体（H7.169, H7.137, H7.57, H7.167和H7.5）仅结合H7的HA，其中H7.5结合H7的3中亚型。H7.134和H7.105结合绝大多数Group2的流感HA，而H7.96结合Group1与Group2。
实验团队后续利用表位竞争实验与X射线晶体衍射技术，解析了相应抗体的结合位点。H7.92在受体结合口袋附近结合，但不能抑制病毒受体相互作用。H7.3和H7.105在低于2μg/ml的浓度下没有表现出HAI活性。它们在不与受体结合口袋附近的区域结合。mAb H7.167是具有最强的HAI活性，在压力选择下产生了两个点突变——N157D / N158bD。当将受体类似物与H7 HA的RBS反应时，重链的可变区显示出明显的位阻。H7.167通过一系列氢键和范德华相互作用靶向H7的高度保守的表位。重链的结合残基位于150 loop、130 loop和190螺旋附近的R131、N157、N158；轻链结合位点则远离RBS的F161、S187、K200和N248。
实验团队直接比较具有或没有HAI活性的H7反应性mAb的可变基因中的突变频率，展现出显着差异。发现H7特异性mAB的突变明显低于H1特异性；其次突细胞突变的频率为：H7异源反应＞广谱中和＞H1特异性＞H5特异性＞H7特异性。
5. Discussion
作者：Natalie J. Thornburg
通讯作者：James E. Crowe Jr
单位：The Vanderbilt Vaccine Center and Department of Pediatrics,Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA.
年份：2016.01.21
期刊：JCI
科学问题：在H7N9疫苗接种者体内特异性抗体情况
讨论：实验团队以疫苗接种者作为研究队列，筛选得到了中和活性低至16 ng/ml的H7.167。
这种抗体具有预防性或治疗性生物学药物潜能，用于治疗H7病毒暴露或感染。事实上在未经历高剂量蛋白免疫或者佐剂辅助的情况下，诱导强效中和抗体十分困难。 目前，尚不清楚HA分子是否具有与禽类宿主相关的抗原特征，以至于他们缺乏人类相关的免疫原性。此处报道的工作表明，H7亚单位疫苗接种以后可以产生拥有一定集结合能力的B细胞。通过后续表位相关实验表明：H7.167主要作用区域为头部的130，150-loop以及190螺旋，此外157与158两个位点的氨基酸与150 loop的相互作用十分特殊，与其特异性相关。实验团队同时比较了不同特异性的抗体的体细胞突变频率，发现H7反应性的克隆突变数为2-23。相对的H1甚至H5的抗体突变数相对较高——平均突变数为18和12。有趣的是，人体理论上第一次接触H7抗原，但是产生的抗体却普遍具体交叉反应性。这些克隆具体显著的体细胞突变，这表明它们是由先前的H3或其他季节性HA暴露引起的记忆B细胞引起的。H7.96对Group1与Group2的HA具有广泛的反应性，该抗体能够中和H3N2但是不能够中和H7N9。
之前有文献报道指出，当抗原携带R131G突变以后会降低结合能力。本研究鉴定的三株抗体：H7.57，H7.137和H7.169与该位点结合。在压力选择下，毒株产生的S132L或 A138D都位于该位点附近。这三个抗体的HAI活性都较为客观，位于0.1至1μg/ml范围内。值得一提的是，所有鉴定的抗体对HA的V186G和L226Q敏感，会显著影响CDR3的结合。
