High tumor mutational burden (TMB) identifies a microsatellite stable pancreatic cancer subset with prolonged survival and strong anti-tumor immunity
高肿瘤突变负荷（TMB）识别出具有延长生存期和强抗肿瘤免疫力的微卫星稳定胰腺癌亚群
发表期刊：Eur J Cancer
发表日期：2022 Jul
DOI: 10.1016/j.ejca.2022.03.033
一、背景
程序性死亡受体-1/配体1（PD-1/L1）抗体可以诱导许多恶性肿瘤的持久缓解并改善预后。然而，与微卫星不稳定性高（MSI-high）/错配修复缺陷（dMMR）肿瘤患者等特定群体相比，未经选择的患者反应率较低，在这些群体中，PD-1/PD-L1阻断已被证明是非常有效的。MSI高的肿瘤对PD-1阻断的敏感性可能与它们的高肿瘤突变负担（TMB）有关，这已被证明可以预测许多癌症类型中检查点阻断的反应。
到目前为止，使用检查点抑制剂的免疫疗法在胰腺导管腺癌（PDAC）中并不成功，主要是由于其免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和肿瘤特异性新抗原的相对低表达和/或低质量，除了一小部分患者由于微生物表位的分子模拟而具有高质量的新抗原。
二、材料与方法
1.数据来源
从2003年至2018年期间在伯尔尼Insel大学医院内脏外科和医学部接受肿瘤切除手术的349名连续PDAC患者中，有5例是MSI高的；从344个MSS病例中，41个是长期生存者（LTS，总生存期（OS）≥60个月；在剩余的303个PDAC中，289个MSS病例符合纳入标准；从这289个病例中，120个随机选择的MSS PDAC被纳入研究，并构成了 "常规 "MSS PDACs队列（队列1）、41名长期生存者组成队列2（LTS-队列）、而5个MSI病例被额外分析以进行比较（队列3：MSI-队列）
2.实验流程
1）免疫组织化学
2）肿瘤突变负荷测定：使用来自所有（n=166）肿瘤样本的30-50 µg DNA和Oncomine肿瘤突变负荷检测（ThermoFisher）
3）mRNA原位杂交：由于技术问题，一个TMB低的病例不能用于最终分析，因此分析包括12个MB高的、28个TMB中的和29个TMB低的PDACs（n=69）。
4）多重免疫荧光(mIF)
5）形态学图像和接近性分析：使用了HALO™图像分析平台（Indica Labs）的免疫细胞模块和HighPlexFL细胞分析模块
6）统计学分析：计算皮尔逊相关系数以确定免疫途径上调以及免疫细胞染色模式和TMB类别之间的相关性；Fisher's exact test、chi-square test、非参数Kruskal-Wallis检验；主成分分析（PCA）；AUC（曲线下面积）分析；K-M生存分析和log-rank检验；多变量Cox回归
三、实验结果
01 - mRNA原位杂交技术
对70个PDACs（12个TMB-高，28个TMB-中间，和29个随机选择的TMB-低的病例）进行无偏见的分级聚类，确定了三个不同的聚类，代表72个免疫通路基因的不同激活水平（图1）。第一个集群显示除B2M（与免疫疗法抗性有关）、CD44（促进癌症干性）和CTNNB1（参与Wnt信号传导并促进上皮-间质转化（EMT））外的所有基因都下调，这个集群被命名为 "免疫失活"，并富含TMB低的肿瘤（13/29；44.8%）。而五个TMB中度的PDAC（5/28；17.8%）聚集在一起，在这个集群中没有发现TMB高的PDACs。相比之下，第三个集群的特点是几乎所有的基因都上调了2到3倍，只有B2M、CD44和CTNNB1下调了。将这个集群命名为 "免疫激活"，包括7个高TMB（7/12；58%）、12个中级TMB（12/28；42.8%）和6个低TMB的PDACs（6/29；20.7%；图1）。中间群组显示大多数基因的上调幅度为0-2倍，被命名为 "免疫中性"，包括5个高TMB（42%）、11个中级TMB（39.3%）和10个低TMB的PDACs（34.5%；图1）。总之，大多数高TMB的PDAC聚集在 "免疫激活"，其余的聚集在 "免疫中性"，而TMB低的肿瘤大多聚集在 "免疫失活 "和"免疫中性 "集群中。TMB中度的PDAC主要聚集在 "免疫中性"和 "免疫激活 "群组。
02 - 免疫反应模式和TMB
高TMB的肿瘤表现出富含T细胞的TMEs，其特点是在上皮内和基质内有大量的CD3+、CD3+CD4+(FOXP3-)T细胞（T辅助细胞）和CD3+CD8+(PD-L1-)T细胞（细胞毒性T细胞）以及CD208+树突状细胞（DCs）（图2，图3，图4）。DCs和T辅助细胞特别突出，尤其是在基质区。相反，低TMB的病例中细胞毒性细胞以及T辅助细胞都很差，而CD68+TAMs和调节性CD3+CD4+FOXP3+T细胞（CD3+Tregs）丰富，而且在基质区的差异表达更明显。TMB-中间型肿瘤大多与TMB-低的病例组合在一起（图2）。为了了解哪些免疫细胞在TMB-高和其他两类之间具有最大的鉴别力，作者采用了AUC分析。使用七个免疫细胞类型的组合，包括CD208+DCs、CD4+T细胞、CD3+CD4+T辅助细胞、CD3+T细胞、CD3+CD8+和CD8+细胞毒性T细胞，以及CD3+CD8+FOXP3+T细胞（CD8+Tregs），综合AUC为0.99。与其他两类TMB相比，在TMB高的肿瘤中，细胞毒性T细胞明显接近肿瘤细胞，T辅助细胞明显接近DC。
在所有的PDACs中，瘤内异质性都很明显，然而，在高TMB的病例中，免疫细胞在不同的肿瘤区域分布得比较均匀，而在TMB中间的肿瘤中则比较突出。
03 - TMB和PD-L1表达模式
在33.3%（4/12）的TMB高位、46.4%（13/28）的TMB中位和24.8%（30/121）的TMB低位PDACs（总体47/161；29.2%；补充图S6）观察到肿瘤和/或免疫细胞的PD-L1表达。根据以前的观察，作者认识到四种不同的PD-L1模式，包括两种适应性（"适应性1 "和"适应性2"）和两种先天性类型反应（"构成性 "和 "结合性"）。除高TMB的肿瘤外，适应性2是所有肿瘤的主要模式，其中适应性1模式更为突出。没有观察到PD-L1表达与TMB水平或TMB类别之间的明显相关性。
04 - TMB和基因改变
测序分析显示，TMB类别与富含AT的交互结构域1 A（ARID1A）的突变之间存在明显的关联，ARID1A是SWitch/Sucrose NonFermentable（SWI/SNF）染色质重塑复合物的一个组成部分。ARID1A突变存在于14个PDACs中（8.4%），在TMB高的肿瘤中更为常见。TMB高的病例占ARID1A突变（ARID1Amut）的21.4%（3/14），仅占ARID1A野生型（ARID1Awt）PDACs的6%（9/152）（补充图S7）。
ERBB4突变的情况也是如此（总体为6/166，3.6%）。六个ERBB4mut肿瘤中的三个（50%）属于TMB-high类别，而只有5.6%（9/160）的ERBB4wt病例是TMB-high（补充图S7）。TMB高的病例在KRASwt和SMAD4wt中更为频繁。关于TP53、CDKN2A或任何其他突变，在TMB类别中没有发现明显差异。
05 - TMB的预后意义
考虑到所有的病例，TMB水平可以将患者分为生存组，在单变量分析中，TMB高的肿瘤的OS和PFS最好，TMB低的肿瘤最差，而TMB中间的肿瘤分层在两者之间（图5）。作者在去除所有LTS后重复分析。剩下的120个常规PDACs被分为TMB-低（≤5个突变/Mb，n = 99）和TMB-高+中间（>5个突变/Mb，n = 21，包括两个TMB-高和19个TMB-中间的病例）。关于这些组之间的OS或PFS没有观察到差异。包括各种重要临床病理参数的多变量分析显示，只有UICC阶段是OS和PFS的独立因素。
四、结论
结果表明，不同TMB类别的PDACs在其免疫反应中显示出质的差异，这与免疫途径的激活和肿瘤细胞的遗传变化有关。具有高TMB水平的PDAC表现出很强的抗肿瘤免疫力，由T辅助细胞/ DC协调的细胞毒性T细胞启动介导，与其微卫星状态和PD-L1表达无关，这表明局部/局部晚期MSS TMB-高PDAC的患者也可能受益于检查点抑制剂治疗。
