引言
现代药物研发中，表型筛选到靶点验证的过程颇具挑战。传统筛选常用荧光、发光或放射性同位素标记，这类“外源性标签”虽方便信号检测，却像 “双刃剑”，易因空间位阻改变靶蛋白天然构象，或引入非特异背景信号，导致假阳性、假阴性结果。
随着生物物理学与蛋白质组学的飞速发展，“免修饰”技术已成为药物靶点筛选领域的新宠。这类技术最核心的优势在于：“所见即所得”—— 即在不改变药物分子和靶蛋白天然状态的前提下，直接监测分子间相互作用引起的物理化学性质变化（如质量、折射率、热稳定性、蛋白酶抗性等）。
结合权威数据库及实验方案库的最新资料，今天我们将全方位拆解免修饰药物靶点筛选技术，从纯化蛋白的生物物理表征到细胞及裂解液环境的蛋白质组学靶点垂钓，为你提供详尽的选型指南与实操避坑手册。
01 基于光学与生物物理传感器的纯化蛋白筛选技术
当研究者已经获得了纯化的潜在靶点蛋白，或者需要对苗头化合物进行亲和力与动力学验证时，基于生物传感器的免修饰技术是首选。这类技术能够实时监测结合过程，提供动力学常数（kon，koff）和热力学参数，这是仅靠终点法（如ELISA）无法获取的维度。
1. 表面等离子体共振（SPR）：相互作用分析的“金标准”
▶ 简化原理：基于全内反射，偏振光照射金膜激发等离子体波，共振角与膜表面折射率相关，靶蛋白固定于芯片，化合物流过引发的共振角偏移（RU值）可量化相互作用。
▶核心优势：
① 能解析结合/解离速率与平衡解离常数，体内疗效与药物驻留时间相关性更高；
② 新一代系统可检测低至70Da的小分子片段，适配片段药物筛选；
③ 单次进样即可形成浓度梯度，提升效率与数据质量。
▶局限性：微流控系统复杂，流路易被粗样品堵塞；缓冲液需严格匹配，仪器与芯片成本较高。
2. 生物层干涉技术（BLI）：高通量与抗干扰的平衡
如果说SPR是精密的“显微镜”，那么BLI就是高效的“流水线”。
▶简化原理：光纤尖端生物膜产生光干涉，分子结合导致膜厚增加，引发干涉光谱位移，采用“浸入即读”模式，无需微流控管路。
▶核心优势：
① 无堵塞风险，可直接检测细胞裂解液、血清等粗样品；
② 样品检测后可回收，支持96/384孔板高通量筛选，成本可控。
▶局限性：灵敏度低于高端SPR，难以检测＜150Da的超小分子或微弱结合信号。
3. 光栅耦合干涉技术（GCI）：灵敏度与动力学的双重飞跃
GCI是近年来异军突起的“黑马”，旨在解决SPR在灵敏度和快动力学检测上的瓶颈。
▶简化原理：光波导表面光栅耦合光产生倏逝波，延伸光与样品相互作用长度，通过时间域相位变化监测折射率改变，降低噪音。
▶核心优势：
① 检测极限＜50Da，可捕捉解离速率高达10s-1的瞬态结合；
② 耐受血清、细胞膜制备物，适用于膜蛋白研究。
▶局限性：设备成本较高。
4. 纯化蛋白筛选技术参数横向对比
为了帮助大家更直观地选择，小谱将上述三种技术及后续将讨论的技术进行了核心参数对比：
02 溶液内热力学与微量热泳动分析
尽管基于表面的生物传感器功能强大，但“固定化”这一步骤本身可能会限制蛋白的构象自由度，或遮蔽结合位点。溶液内检测技术则规避了这一风险。
1. 等温滴定量热法（ITC）：热力学解析的“金标准”
▶简化原理：直接测量分子结合时的热量变化，无需标记或固定，通过热量信号量化相互作用。
▶核心优势：一次实验可获取亲和力、化学计量比、焓变、熵变，能区分焓驱动（氢键/范德华力，特异性好）与熵驱动（疏水作用，亲脂性可能较高）结合，指导化合物优化。
▶局限性：样品消耗大（毫克级）、通量低，不适合大规模初筛；对极高/极低亲和力结合的拟合数据可能有偏差。
2. 微量热泳动（MST）：微量、广谱的溶液内检测
▶简化原理：分子在温度梯度中定向移动，配体结合改变分子水化层、大小等性质，导致热泳动速度变化。
▶核心优势：
① 样品消耗仅4-10μL，检测范围覆盖pM至mM级；
② 支持蛋白内源性色氨酸荧光检测，适配无法标记或标记后失活的蛋白。
▶技术陷阱：易受聚集与非特异性吸附干扰，可添加表面活性剂或使用特殊涂层毛细管；内源性荧光模式下，配体不可在UV区有强吸收。
03 复杂生物体系中的靶点垂钓与确证
当研究者通过表型筛选发现了一个具有生物活性的化合物（如诱导癌细胞凋亡的天然产物），但不知道其具体靶点时，上述基于纯化蛋白的技术便无用武之地。此时，需要在细胞裂解液甚至活细胞层面进行的“靶点垂钓”技术成为了关键。
1. 细胞热位移分析（CETSA）：活细胞内的靶点验证
▶简化原理：药物结合提升靶蛋白热稳定性，加热后未结合药物的蛋白变性沉淀，结合药物的靶蛋白保持可溶。
▶核心流程：药物处理样品→梯度/单一温度热激→离心分离→Western Blot检测可溶蛋白。
▶实操要点：使用含非离子型去污剂的温和裂解液，避免强离子型去污剂导致假阴性；先测定靶蛋白熔解温度，筛选温度设为80%-90%蛋白沉淀的温度。
2. 热蛋白质组学谱（TPP）：全蛋白质组层面的“无偏见”筛选
▶简化原理：结合CETSA与定量质谱，构建数千个蛋白的熔解曲线，实现未知靶点发现。
▶核心流程：样品经不同温度处理→酶解肽段→TMT标记→LC-MS/MS分析→比较报告离子强度。
▶核心优势：可发现直接靶点、脱靶效应及下游通路变化，“一锅法”策略提升初筛通量，覆盖＞6000种蛋白。
3. 药物亲和力响应靶点稳定性分析（DARTS）：天然产物的首选
▶简化原理：药物结合增强蛋白对蛋白酶的抗性，通过检测酶解后存活的蛋白筛选靶点。
▶核心优势：无需修饰天然产物，避免修饰导致的活性丧失，实验门槛低。
▶实操要点：严格控制酶/蛋白比例（Pronase 1:100-1:300，Thermolysin 1:10）；设置溶剂对照组，检测内参蛋白排除药物对蛋白酶活性的抑制。
4. 限制性蛋白酶解-质谱技术（LiP-MS）：结构指纹的解析者
▶简化原理：非特异性蛋白酶短时间酶解蛋白，药物结合改变酶切位点可及性，通过肽段指纹变化鉴定靶点并定位结合位点。
▶核心优势：分辨率达肽段水平，可区分变构效应，需用FragPipe+FLiPPR软件处理数据。
04 免修饰筛选技术的综合决策树
面对如此繁多的技术，研究者该如何抉择？以下决策树可供参考：
场景一：已有纯化蛋白，需筛选/验证化合物库
① 小分子/片段筛选（<150Da）：首选GCI或高灵敏度SPR。GCI在极小分子检测和快解离动力学上具优势。
② 粗制样品/高通量初筛：首选BLI。耐受杂质，速度快，成本相对可控。
③ 需深度热力学机制（焓/熵）：唯有ITC。尽管耗样大，但数据维度不可替代。
④ 样品极其珍贵/易聚集：尝试MST。微量、溶液内检测，避开表面固定化难题。
场景二：已知表型，需鉴定未知靶点
① 无质谱平台，主要关注特定候选蛋白：CETSA(Western Blot)或DARTS。低成本，实验室通用性强。
② 有质谱支持，需全蛋白质组扫描：TPP(CETSA-MS)。目前最成熟的组学靶点发现工具，覆盖度广（>6000蛋白）。
③ 需了解结合位点/关注结构变化：LiP-MS。提供结构分辨率，可区分变构效应。
④ 针对膜蛋白靶点：改进版CETSA（使用非离子去污剂）或GCI（结合Nanodiscs技术）。
前沿展望与结语
随着人工智能（AI）与多组学技术的深度融合，免修饰筛选正迎来新的变革。机器学习算法已被用于预测LiP-MS中的酶切位点变化，辅助解释复杂的构象动态。同时，微流控与类器官技术的结合，使得在更接近人体生理环境的3D模型中进行免修饰靶点验证成为可能。
对于广大生物医学研究者而言，没有一种技术是万能的。“组合拳”策略往往最为有效：例如，先用TPP进行全谱筛选圈定候选列表，再用CETSA/WB进行验证，最后通过SPR/GCI测定精确动力学，并辅以LiP-MS解析结合模式。这种多维度、互相印证的证据链，将极大提升药物靶点发现的成功率，让您的研究经得起时间的考验。
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LiP - MS科研buff 加持！药物靶点研究3大场景轻松破局
▶ 药物靶点筛选：在体外生理条件下，寻找小分子药物可能的作用靶点。
▶ 药物 - 蛋白结合域分析：于体外生理条件中，探究纯化重组蛋白和目标药物的作用区域以及结合位点。
▶ 药物机制研究：在体内给药的条件下，钻研小分子药物潜在的作用靶点及其发挥作用的机制。
参考资料
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