Cell | 靶向线粒体凋亡增强NK细胞免疫治疗

原创 骄阳似我 图灵基因 2022-05-03 19:54

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：41.582

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亮点：

本研究发现线粒体凋亡（mtApoptosis）对于NK细胞至关重要，尤其在生理相关效应物与靶点的比例下。此外，NK细胞可以引发癌细胞的线粒体凋亡，线粒体启动状态影响癌细胞对NK介导的杀伤的易感性。预激活的NK细胞赋予它们对BH3模拟物的抵抗力。BH3模拟物与NK细胞联合在体外协同杀死癌细胞，在体内抑制肿瘤生长。本文报告一种合理且精确的策略来增强基于NK的免疫治疗，它也可能适用于基于T细胞的免疫治疗。

NK细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，其特征是能够自发检测并杀死感染或恶性细胞。NK细胞使用一系列激活受体识别应激癌细胞上上调的生殖系编码配体，而不像T细胞那样需要MHC分子呈现肿瘤新抗原。因此，NK细胞可以杀死突变负荷低或缺乏新抗原呈递的癌细胞。因此，大多数癌症可能对NK细胞疗法产生反应，NK细胞可能对抗基于T细胞的疗法的耐药性。目前，以NK为基础的治疗方法是过继转移异基因NK细胞。过继性NK细胞转移相对安全，发生移植物抗宿主病或细胞因子释放综合征（CRS）的风险较低。

为了提高NK细胞的治疗效果，目前的研究主要围绕两个焦点：优化NK细胞的来源和改善其在体内功能和持久性。近期，在Cell杂志上发表了一篇名为“Augmenting NK cell-based immunotherapy by targeting mitochondrial apoptosis”的文章，采取不同的方法研究如何使癌细胞更容易被NK杀伤。本文发现线粒体凋亡（mtApoptosis）在NK介导的杀伤中起着重要作用。调节线粒体凋亡启动状态（线粒体对凋亡的准备）影响癌细胞对NK细胞的易感性。此外，NK治疗使存活的癌细胞更接近mtApoptosis阈值。BH3模拟物与NK细胞联合在体外协同杀死癌细胞，在体内抑制肿瘤生长。

NK细胞和T细胞可以传递颗粒酶或利用死亡配体触发癌细胞凋亡。然而，目前尚不清楚NK细胞介导的杀伤需要多大程度的mtApoptosis机制，尤其是在相对较低的效应靶比（E:T）下。本研究中首先研究了原代NK细胞是否在相对较低的E:T比率下诱导mtApoptosis或其他形式的程序性细胞死亡。OCI-AML3被选为代表血液癌症，HeLa宫颈癌细胞系被选为实体癌代表。对于效应细胞，从健康捐赠者的白细胞分离样本中分离出原代NK细胞，并命名为将其命名为“NK#n”，并以“n”作为其在本研究中的使用顺序。分离的NK细胞被预激活并用100 IU/mL白细胞介素-2（IL-2）扩增，接下来在不同的E:T比率和时间点将CFSE标记的癌细胞与预激活的NK细胞共同培养。通过CMXRos染色确定，预激活的NK细胞导致线粒体外膜电位丧失，并迅速触发线粒体释放细胞色素c，还迅速激活了caspase-3，并触发磷脂酰丝氨酸外化。NK处理诱导BID、caspase-9、-8、-3和PARP-1的分裂，并导致靶细胞起泡和凋亡小体的形成，这是凋亡的典型形态学特征。这些特征共同表明，原代NK细胞可诱导mtApoptosis。NK细胞很快诱导癌细胞凋亡，在不同的细胞系中使用不同的方法数小时后即可检测到。除此之外，本文还发现NK细胞诱导细胞凋亡不涉及坏死性、热下垂性和铁下垂性形式的细胞死亡，NK介导的杀伤需要细胞间的接触，死亡配体有助于NK杀伤，但程度有限。图1：预激活的NK细胞可诱导癌细胞凋亡，但不会引起坏死性下垂、铁下垂或热下垂。

探究mtApoptosis凋亡对于有效杀死NK细胞是否有效。首先使用BAX/BAK双基因敲除（DKO）细胞验证了HeLa-DKO细胞确实存在mtapotosis缺陷。接种HeLa WT或DKO细胞，然后以相对较低的E:T比1:2添加NK细胞，在WT对照细胞中，NK细胞诱导的凋亡呈时间依赖性增加，而在DKO细胞中仅观察到最低水平的凋亡。在NK处理10小时后存活下来的DKO细胞明显多于野生型细胞。接下来研究了E:T比率对NK介导杀伤的影响。在较低的E:T比率下，NK细胞容易诱导WT细胞凋亡，但在DKO细胞中仅观察到轻微的细胞死亡，这表明在较低的E:T比率下，NK细胞凋亡机制对NK细胞杀伤至关重要。然而，在高E:T比率下，MTapotosis对于NK杀伤可能是不必要的。图2：线粒体凋亡机制对于有效杀伤NK细胞至关重要，尤其是在E-T比率≤1。

mtApoptosis对于使用二元活/死检测有效杀伤NK细胞至关重要。效应器-靶细胞接触主要是亚致死性的，而不是“活/死”二元事件，亚致死性损伤可通过后续接触累积，最终杀死癌症。本文使用BH3分析法调查了这个问题。BH3分析是一种整合21种已知BCL-2家族蛋白相互作用的工具。以1:2的E:T比将NK细胞与癌细胞共同培养2小时，其中80%-90%的癌细胞存活，并对门控活细胞进行BH3分析，结果NK治疗显著增加了存活细胞的整体线粒体启动和抗凋亡依赖性。接下来重点研究仅使用BIM肽的BH3谱，两种NK样本都有效地提高了3/3血癌细胞系的整体启动能力。类似地，两个NK样本也有效地激发了3/3实体癌细胞系。与固体细胞相比，血癌细胞似乎更容易被NK细胞激发。还检测了共同培养的癌细胞随着时间的推移的启动状态。在所有测试时间点，作为一个群体，存活的癌细胞比未经治疗的对照组更容易发生mtApoptosis，且NK诱导的启动在随后的时间点低于2小时。图3：NK细胞能有效地激发癌细胞的凋亡。

接下来研究了BCL-2、BCL-XL和MCL-1的过度表达如何影响癌细胞启动状态及其对NK细胞的易感性。BIM肽的BH3分析表明，BCL-2过度表达显著降低了HL-60细胞的整体启动状态。接下来在两个E:T比率和两个时间点将BCL-2过表达与相对较弱的NK#10和相对较强的NK#11共同培养。BCL-2过表达者对NK介导的杀伤作用变得不那么敏感。BCL-XL的过度表达也显著降低了整体线粒体启动。正如预期的那样，NK细胞对BCL-XL过度表达的效果较差。同样，MCL-1的过度表达显著减少了线粒体启动，并减少了弱杀伤和强杀伤在所有测试条件下的杀伤。这些结果表明，减少启动使癌细胞不易被NK杀伤。图4：线粒体启动减少使癌细胞不易被NK介导的杀伤。

已经证明NK细胞和BH3模拟物的作用在细胞凋亡上是一致的，并且预激活的NK细胞可以耐受BH3模拟物，接下来测试NK细胞和BH3模拟物是否能协同杀死癌细胞，以及BH3分析是否能预测哪种模拟物是理想的组合。BH3分析表明，HeLa细胞对MCL-1具有抗凋亡依赖性，只有MCL-1i显著增强NK诱导的HeLa细胞启动，而BCL-2i或BCL-XLi则没有。此外，MCL-1i与NK细胞协同杀死HeLa细胞，而BCL-2i或BCL-XLi则没有协同作用。接下来选择HL60-BCL2，一种具有不同于HeLa细胞的抗凋亡依赖性的血癌细胞系以进一步检验假设，结果表明只有BCL-2i触发了delta启动的显著增加，只有BCL-2i增强了NK诱导的启动。更重要的是，BCL-2i与NK细胞协同杀伤靶细胞，而其他两种组合完全没有协同作用。HL60-BCLXL和OCI-AML3-MCL1细胞分别依赖BCL-XL和MCL-1存活。据推测，BCL-XLi和NK细胞协同诱导BCL-XL依赖细胞凋亡。同样MCL-1i与NK细胞协同杀伤OCI-AML3-MCL1细胞。尽管一些治疗性抗体可能通过诱导ADCC来增强NK细胞的杀伤作用，但通过增强靶癌细胞的线粒体启动，另一种机制也可能起作用。总之，BH3模拟物能够与NK细胞协同启动和杀死癌细胞。本文在免疫治疗的背景下进行了BH3分析实验，并证明NK细胞和BH3模拟物之间的协同作用也可以通过BH3分析来预测。图5：选择性BH3模拟物与NK细胞协同杀死癌细胞，这可以通过BH3分析预测。

本文说明了mtApoptosis机制对于有效杀伤NK细胞至关重要，并提出靶向mtApoptosis以增强NK抗肿瘤疗效。使用多种体外和体内模型，证明了BH3模拟物和NK细胞在杀死癌细胞方面有明显的协同作用，BH3谱可以用来合理选择BH3模拟物与NK细胞结合。本文的研究结果可以作为未来临床试验的基础，测试NK细胞与BH3模拟物的组合，这种方法可能也适用于基于T细胞的免疫疗法。本文提出了一种合理的策略，使癌细胞对细胞毒性细胞介导的杀伤敏感，并提出了一种治疗途径，以在实验室和临床上进行测试。

教授介绍：

Anthony Letai

Anthony G. Letai，医学博士，博士，哈佛医学院和 Dana Farber 癌症研究所的医学教授。Anthony Letai 在芝加哥大学获得医学博士和博士学位，并在 Dana-Farber 癌症研究所完成了血液学和肿瘤学的临床培训。在与 Stanley Korsmeyer 进行博士后研究后。自 2004 年以来，Letai 博士在哈佛医学院和 Dana-Farber 癌症研究所开设了一个实验室，研究癌细胞如何逃避细胞凋亡。这些研究的关键是一种新的检测方法——BH3 分析。他领导了将 BCL-2、BCL-XL 和 MCL-1 拮抗剂转化为临床的工作。其中包括 venetoclax，这是一种 BCL-2 拮抗剂，已获 FDA 批准用于治疗 CLL 和 AML，目前正在对几乎所有血癌进行测试。该实验室正在测试 BH3 分析是否可以用作广泛的预测生物标志物来分配临床癌症治疗。

参考文献：

Pan, R., et al., Augmenting NKcell-based immunotherapy by targeting mitochondrial apoptosis. Cell, 2022.