单细胞文章层出不重，但是数据格式不统一，卡卡在重现大量文章数据的时候发现，有的文章提供的是处理后的单细胞矩阵，而不是原始counts，甚至有的文章提供的数据是scaled data，这样我就有疑问：直接利用scaled data或者normalized counts能否进行单细胞分析，首先我们来回顾一下单细胞分析的基本步骤：

单细胞基本步骤（Seurat包为例）

• 读取raw counts构建seurat对象
• 数据进行lognormalized，去除细胞间的差异
• 获取高可变基因，即FindVariableFeatures函数
• 数据scaled得到scaledata，统一量纲
• 根据scaled data进行PCA降维
• 利用FindClusters函数进行分群
• 人工或自动注释，给细胞以标签

  如果文章只提供scaled data的话，我们可以略过lognormalized和scaledata步骤，但是FindVariableFeatures用来发现高可变基因，似乎只有scaled data不能用来获取高可变基因，且这一步的高可变基因会用于后续PCA降维等分析，也不能省略，那么是否可以用scaled data来获取高可变基因呢？为此我看了下FindVariableFeatures的源码（Seurat V3版本）：

    if (selection.method == "vst") {
        data <- GetAssayData(object = object, slot = "counts")
        if (IsMatrixEmpty(x = data)) {
            warning("selection.method set to 'vst' but count slot is empty; will use data slot instead")
            data <- GetAssayData(object = object, slot = "data")
        }
    }
    else {
        data <- GetAssayData(object =object, slot = "data")
    }

  可以看到，源码中高可变基因的获取是利用raw counts矩阵或者lognormalized data的矩阵来计算的，也就是说seurat作者认为scaled data来计算高可变基因可能是不准确的，因此文章只提供了scaled data理论上是不能进行高可变基因的计算的。
  当然，会有好(tai)奇(gang)的人问了，我就是要用scaled data来运行FindVariableFeatures，会得到比较可靠的高可变基因吗？为此，我测试了下运用raw counts, lognormalized data, scaled data来分别进行高可变基因获取，并比较异同：

PRO <- readRDS('/mydir/seurat.diff_PRO.rds')
PRO  <- FindVariableFeatures(PRO,selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
gene_counts <- VariableFeatures(object = PRO)

PRO@assays$RNA@counts <- PRO@assays$RNA@data
PRO  <- FindVariableFeatures(PRO,selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
gene_data <- VariableFeatures(object = PRO)

PRO<- ScaleData(PRO,features=rownames(PRO))
PRO@assays$RNA@counts <- PRO@assays$RNA@scale.data
PRO  <- FindVariableFeatures(PRO,selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
gene_scaledata <- VariableFeatures(object = PRO)

length(intersect(gene_counts,gene_data))
842
length(intersect(gene_counts,gene_scaledata))
141
length(intersect(gene_data,gene_scaledata))
103
length(intersect(gene_scaledata,c(gene_data,gene_counts)))
174

  可以看到，利用scaled data计算出来的高可变基因与使用raw counts和lognormalized data计算出来的差别是很大的，而使用raw counts和lognormalized data得到的高可变基因的一致性远高于使用scaled data，因此卡卡认为使用scaled data获取的高可变基因是不靠谱的。从理论上来想也很好理解，高可变基因是在细胞间变化程度大的基因，scaled data将方差矫正为1，当然会使结果有很大的偏差。
  那么没有高可变基因是不是就不能进行PCA降维等分析了呢？理论上当然不是，RunPCA可以自己指定基因来运行。

文章只提供scaled data可否运行seurat标准流程

卡卡最近实际上是在构建单细胞数据库，个人认为这样的数据是可以放弃分析的，理由如下：

• 无法进行可信的高可变基因的获取
• 无法和其他正常数据整合分析
• 这样的数据占比不高，卡卡分析了数百篇高分文章，只发现了3篇