****pySCENIC全部往期精彩系列：
1、PySCENIC（一）：python版单细胞转录组转录因子分析
2、PySCENIC（二）：pyscenic单细胞转录组转录因子分析
3、PySCENIC（三）：pyscenic单细胞转录因子分析可视化
4、PySCENIC（四）：pyscenic结果之差异转录因子分析及其他可视化首先说一句，我们之前也发过R语言版本的SCENIC，但是后来我们感觉容易出错，而且费时，所以就没有再探究过。可是总是有小伙伴喜欢跑R，然后说这里错了，那里找不见，其实我们的帖子写于2022年，但是数据库已经更新了，去官网下载新的数据库，不能无脑跑代码。回到pySCENIC,之前我们写过整个系列4篇帖子，分析可视化都是很完善了。可是近期跑的时候发现在第一步有点问题，要么跑不动，要么出错，怀疑是软件和数据库没有更新的缘故，故而更新一下测试。这个帖子主要有两部分内容。

Section1

首先准备单细胞数据，我们准备了27001个基因6000个细胞的数据：提取表达数据，这些操作和之前的一样，没有区别。

#====================================================================================
#                               1、R中提取seurat单细胞counts矩阵
#====================================================================================

setwd("D:/KS项目/公众号文章/pySCENIC更新")
library(Seurat)
dim(uterus)
# [1] 27001 27914
table(uterus$orig.ident)
# AEH   EEC    HC 
# 9525 12033  6356
#对于每个样本抽取2000个细胞进行分析，这里只是演示，太多细胞没有意义,也是为了降低文件大小
Idents(uterus) <- 'orig.ident'
sce_test <- subset(x = uterus, downsample = 2000)
table(sce_test$orig.ident)
# AEH  EEC   HC 
# 2000 2000 2000 
table(sce_test$celltype)
# Ciliated epithelial cells           Endothelial cells                 Lymphocytes 
# 427                         631                        2844 
# Macrophages         Smooth muscle cells         Stromal fibroblasts 
# 110                         474                         593 
# Unciliated epithelial cells 
# 921 

dim(sce_test)#我们用这6000个细胞进行演示
# [1] 27001  6000


#提取表达矩阵，用于后续分析
Idents(sce_test) <- 'celltype'
write.csv(t(as.matrix(sce_test@assays$RNA@counts)),file = "sce_exp.csv")
saveRDS(sce_test, file = 'sce_test.rds')

我们这次干脆一不做二不休，将之前的pyscenic的环境删除干净，重新建立环境，重新下载最新版软件pyscenic0.12.1好了。准备的数据集也用最新的。数据库网址：https://resources.aertslab.org/cistarget/databases/，需要什么自己下载选择即可。

#删除之前的环境，重新建立环境并下载软件
conda info --envs
conda env remove -n pyscenic
#创建环境
conda create -y -n pyscenic python=3.7
conda activate pyscenic
pip install pyscenic -i http://pypi.douban.com/simple/ --trusted-host pypi.douban.com
pip install scanpy -i http://pypi.douban.com/simple/ --trusted-host pypi.douban.com


#需要的数据库下载
#1、Databases ranking the whole genome  ：https://resources.aertslab.org/cistarget/databases/
#我这里是人的：#需要下载什么。自己实际选择
wget https://resources.aertslab.org/cistarget/databases/homo_sapiens/hg38/refseq_r80/mc_v10_clust/gene_based/hg38_10kbp_up_10kbp_down_full_tx_v10_clust.genes_vs_motifs.rankings.feather

#2、Motif to TF annotations database 
wget https://resources.aertslab.org/cistarget/motif2tf/motifs-v10nr_clust-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl

#3、A list of transcription factors 
wget https://resources.aertslab.org/cistarget/tf_lists/allTFs_hg38.txt

这是所有软件版本

image.png

分析的话很好办，还是和之前一样，标准的3步。第一步我们花了大概12多小时。后面的步骤就比较快了。运行是没有任何问题。甚至最后的结果loom文件我们用之前的R可视化代码直接“闭眼”运行，没有任何问题，所以在这里出问题的小伙伴，考虑下自己数据的问题，软件的问题。

pyscenic grn --num_workers 10 \
--sparse \
--method grnboost2 \
--output grn.csv \
sce.loom \
allTFs_hg38.txt

pyscenic ctx --num_workers 10 \
--output regulons.csv \
--expression_mtx_fname sce.loom \
--mode "custom_multiprocessing" \
--motifs-v10nr_clust-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl\
grn.csv \
hg38_10kbp_up_10kbp_down_full_tx_v10_clust.genes_vs_motifs.rankings.feather


pyscenic aucell --num_workers 6 \
--output sample_SCENIC.loom \
sce.loom \
regulons.csv

image.png

到这里我们还想探讨一个问题，那就是第一步为什么那么慢，如果仔细了解过的话都知道，第一步的目的是推断转录因子与提供的表达矩阵基因的共表达模块，所以慢就是因为基因多，所以前面我们第一步就是因为运行了所有的基因。这里我们测试了两个数据，一个是1000个基因1500个细胞，一个是1000个6000个细胞，发现运行时间是一样的。

#一个比对
#1000个基因1500个细胞的运行时间
2023-05-30 09:06:44,608 - pyscenic.cli.pyscenic - INFO - Loading expression matrix.
2023-05-30 09:06:44,765 - pyscenic.cli.pyscenic - INFO - Inferring regulatory networks.
2023-05-30 09:09:02,645 - pyscenic.cli.pyscenic - INFO - Writing results to file.

#1000个基因6000个细胞的运行时间
2023-05-30 09:32:42,268 - pyscenic.cli.pyscenic - INFO - Loading expression matrix.
2023-05-30 09:32:42,531 - pyscenic.cli.pyscenic - INFO - Inferring regulatory networks.
2023-05-30 09:35:03,436 - pyscenic.cli.pyscenic - INFO - Writing results to file.

所以我们建议在运行之前，可以对基因进行过滤，例如只有几个细胞表达的基因，或者大多数细胞表达为0的基因可以过滤后在进行分析，因为这些基因没有实质的意义和贡献，对于数据的分析结果也没有影响，还能提高效率。这个思路我认为是没有什么问题的。

Section2

Section1的方式我们之前的帖子说过，相信很多小伙伴已经了解掌握了，只需要更新数据库和软件即可。那么这一部分我们增加的是利用docker镜像进行pyscenic分析。关于docker这里不展开说，可以自行百度。其实爱学习的小伙伴在pyscenic官网的步骤中已经看到了作者讲的，docker镜像分析的步骤。docker的一个优势是速快稍微快一点，不容易出错，我们也测试了，好像是快那么一点。docker的安装需要root权限，所以不懂linux的小伙伴最好不要动，因为sudo很容易搞坏电脑。如果是服务器，一般共享的也没root权限。docker的安装可联系管理员。本地的linux子系统当然是可以安装的。

#安装docker，需要root权限
# 参考：
# 知乎：https://zhuanlan.zhihu.com/p/433898505
# docker官网：https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
sudo apt-get update
sudo apt-get install ca-certificates curl gnupg

sudo install -m 0755 -d /etc/apt/keyrings
curl -fsSL https://download.docker.com/linux/ubuntu/gpg | sudo gpg --dearmor -o /etc/apt/keyrings/docker.gpg
sudo chmod a+r /etc/apt/keyrings/docker.gpg

echo \
"deb [arch="$(dpkg --print-architecture)" signed-by=/etc/apt/keyrings/docker.gpg] https://download.docker.com/linux/ubuntu \
  "$(. /etc/os-release && echo "$VERSION_CODENAME")" stable" | \
sudo tee /etc/apt/sources.list.d/docker.list > /dev/null

sudo apt-get update
sudo apt-get install docker-ce docker-ce-cli containerd.io docker-buildx-plugin docker-compose-plugin

docker --help

# Usage:  docker [OPTIONS] COMMAND
# 
# A self-sufficient runtime for containers
# 
# Common Commands:
#   run         Create and run a new container from an image
# exec        Execute a command in a running container
# ps          List containers
# build       Build an image from a Dockerfile
# pull        Download an image from a registry
# push        Upload an image to a registry
# images      List images
# login       Log in to a registry

sudo service docker start
service docker status

安装好docker后，我们就可以下载pyscenic了。

#docker安装最新版pyscenic
sudo docker pull aertslab/pyscenic:0.12.1
# sudo: /etc/sudoers.d is owned by uid 1000000, should be 0
# [sudo] password for tq_ziv: 
#   0.12.1: Pulling from aertslab/pyscenic
# 1efc276f4ff9: Pull complete 
# 126aaa6587b8: Pull complete 
# 0dd06b55ca68: Pull complete 
# 3950cece0b72: Pull complete 
# a4cc5c9d5acb: Pull complete 
# bdf10448670a: Pull complete 
# 6c5350e3d2c5: Pull complete 
# Digest: sha256:0c06b8b0a00117e1a4b61303e9ad775bf53c9e410d4c344151c15bf0d143a288
# Status: Downloaded newer image for aertslab/pyscenic:0.12.1
# docker.io/aertslab/pyscenic:0.12.1

# pySCENIC CLI version + ipython kernel + scanpy.
docker pull aertslab/pyscenic_scanpy:0.12.1_1.9.1

分析也是基本的三部：

#run pyscenic
#step1
sudo docker run -it --rm \
     -v /home/tq_ziv/pyscenic:/pyscenic aertslab/pyscenic:0.12.1 \
     pyscenic grn \
     --num_workers 10 \
     --method grnboost2 \
     --output /pyscenic/grn.csv \
     --sparse \
     /pyscenic/sce.loom \
     /pyscenic/allTFs_hg38.txt

#step2
sudo docker run -it --rm \
     -v /home/tq_ziv/pyscenic:/pyscenic aertslab/pyscenic:0.12.1 \
     pyscenic ctx \
     /pyscenic/grn.csv \
     /pyscenic/hg38_10kbp_up_10kbp_down_full_tx_v10_clust.genes_vs_motifs.rankings.feather \
     --annotations_fname /pyscenic/motifs-v10nr_clust-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl \
     --expression_mtx_fname /pyscenic/sce.loom \
     --mode "custom_multiprocessing" \
     --output /pyscenic/regulons.csv \
     --num_workers 10

#step3
sudo docker run -it --rm \
     -v /home/tq_ziv/pyscenic:/pyscenic aertslab/pyscenic:0.12.1 \
     pyscenic aucell \
     /pyscenic/sce.loom \
     /pyscenic/regulons.csv \
     -o /pyscenic/sample_SCENIC.loom \
     --num_workers 6

这样就完成了，分析结束后按照之前的帖子进行下游的分析和可视化即可。这就是pyscenic的全部内容了。时不时更新下数据库，更新下软件，切记不可拿到别人的代码不思考便运行，不可能顺利拿到结果。觉得分享有用的点个赞、分享一下再走呗！当然了一般的共享服务器是没有root权限的，也不可能用sudo命令进行操作。可以参考我们专属的服务器：专属注册链接：https://www.xiyoucloud.net/aff/OXAAYEPJ