在诸如：ChIP-seq、ATAC-seq、MeRIP-seq(m6A)、Cut&Tag中我们常常听到一个词Call Peak。Call Peak究竟是什么东西，得到的结果又有什么生物学意义呢？

概念

Call Peak其实是一种计算方法，用于识别基因组中由测序得到的比对reads富集的区域。
其实通俗的来说Call peak就是把我们有蛋白富集到核酸时的区域给找出来。

• 对于ChIPseq/Cut&Tag来说我们这个区域就是我们的转录因子所可以和DNA互作的区域；
• 对于ATAC-seq来说这个就是特定条件下的开放染色质的区域；
• 对于m6A测序来说就是发生m6A甲基化修饰的RNA区域。

方法

为了找个蛋白结合核酸的区域，我们需要进行计算，因为其实在通过测序我们得到的只不过是蛋白结合核酸片段的末端，而非蛋白真正的结合区域。所以就需要在得到的reads进行延伸，如下图：

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理想情况下，我们认为测得的reads最终其实会近似地平均分配到正负链上，这样，对于一个结合热点而言，reads在附近正负链上会近似地形成“双峰”，我们偏移后就可以得到真正的结合区域了。

常用软件

常用的Call Peak软件很多，但总体上根据它们的推测peak的方法总体上可以分为3类：
1.基于马尔科夫模型：HMMRATAC；
2.基于count：MACS2、HOMER、F-seq等；
3.基于峰形状：PICS、PolyaPeak、CLC等。

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不同的peak caller软件有各自适用的范围，但是理论上这些软件都可以去做蛋白-核酸的call peak，对于各个软件最适合的使用场景如下图：

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MACS2原理

MACS2是最常用的call peaks工具，是ENCODE的ChIP-seq和ATAC-seq流程采用的工具。 MACS全称Model-based Analysis of ChIP-Seq，该工具是大名鼎鼎的Liu tao大神开发。最初的设计是用来鉴定转录因子的结合位点，但是理论上它也可以用于其他的DNA-蛋白结合类型的富集方式测序分析。

软件的计算流程如下：

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1. 去重：首先软件会对数据进行去重处理；
2. 建模：前面在图1中，我们谈到了reads在附近正负链上会近似地形成“双峰”，这个双峰之间的距离称之为d，软件需要进行延伸需要知道这个d值。所以MACS2选取了1000个表达10~30倍的regions去建模以计算这个d值。
3. 延伸：得到了d之后，向3'端延伸就可以去进行延伸，延伸长度为d/2；
4. 归一化：把两组数据进行归一化，各组数据可比；
5. 获得候选的peak和背景进行比较；
6. 计算确定λ，代入泊松分布，得到p值；

   补充知识：
   （1）假设TF在基因组上的分布是没有任何规律，测序得到的read在基因组上的分布也必然是随机的，某个碱基上覆盖的read的数目应该服从二项分布。当n很大，p很小时，二项分布可以近似用泊松分布替代。
   （2）在MACS2中，它并不是使用一个固定的λ值，而是采用了一个动态规划的思路，服从λlocal = max(λBG, λ1k, λ5k, λ10k)，泊松分布的公式和模型如下图：

   
   

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   λ是滑动窗口的期望值， n是测序得到的read总数目， l是单个read的长度，s是基因组的大小

从上述的公式中我们可以看到，n、l、s都是确定的，所以只需要确定了λ我们就可以得到P值。如果只是随机分布的片段他们会落在上述密度分布图封顶的两端，两边的概率是极小的，MACS2使用了单边检验，当落在右边的P达到了阈值时候，我们就认为这个是我们要找的peak了。

7. 计算FDR：当有对照组存在时候，就可以得到两个P，FDR=P(对照组)/P(实验组)

实操

其实MACS2已经更新到了MACS3了，简单介绍下使用方法：

寻找ChIP-seq的转录因子（TF）的命令：
macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -B -q 0.01

寻找ChIP-seq的组蛋白（Histone ）Mark的命令：

macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam --broad -g hs --broad-cutoff 0.1

对于ATAC-seq双端数据的操作：

macs3 callpeak -f BAMPE -t ATAC.bam -g hs -n test -B -q 0.01

-f是输入文件的格式，可以是BAM、BED，软件可以自动识别，但是需要注意自动识别是无法区分是PE还是SE，所以建议手动指定；
-g是有效基因组大小，软件预设了模式物种的有效因组大小，如果hs人，mm小鼠；
-n是样本名字；
-B是以bedGraph格式存放fragment pileup, control lambda, -log10pvalue 和log10qvale,使用会增长耗时；
-q就是用q值（FDR）进行筛选，输入得到值为阈值；
broad-cutoff用于过滤 broad得到的peak。

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