DPP7调控结直肠癌肿瘤相关巨噬细胞功能的研究解读
一、文章信息
发表杂志名称：International Journal of Biological Sciences
中文标题：DPP7促进结直肠癌肿瘤相关巨噬细胞的脂肪酸β-氧化并塑造免疫抑制微环境
英文标题：DPP7 promotes fatty acid β-oxidation in tumor- associated macrophages and determines immunosuppressive microenvironment in colorectal cancer
影响因子：10
发表日期：2025年10月01日
二、研究概述
结直肠癌（CRC）中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是免疫抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）的关键调控者，但目前仍缺乏明确的TAMs功能调控基因作为免疫治疗靶点。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）筛选出TAMs中高表达的关键基因二肽基肽酶VII（DPP7），发现DPP7⁺TAMs与CRC患者转移及不良预后密切相关。功能上，DPP7⁺TAMs呈现M2极化表型，通过诱导CD8⁺T细胞耗竭构建免疫抑制微环境。机制上，DPP7与肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）结合，竞争性抑制TRIM25介导的CPT1A泛素化降解，增强TAMs的脂肪酸氧化（FAO），促进能量代谢重编程。体内实验证实，敲低骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中的DPP7可协同抗PD-1治疗，逆转免疫抑制微环境，显著抑制CRC皮下移植瘤生长及肝转移。该研究首次揭示DPP7作为TAMs代谢重编程的核心调控因子，为CRC免疫治疗提供了新的潜在靶点。
三、研究目标与解决的实际问题
1. 研究目标
筛选结直肠癌（CRC）中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的关键功能基因，明确其临床预后价值；
阐明该基因调控TAMs表型及功能的分子机制，尤其是代谢重编程相关通路；
验证靶向该基因联合免疫检查点抑制剂（如抗PD-1）治疗CRC的可行性及协同效应。
2. 解决的实际问题
破解CRC免疫治疗响应率低的困境：CRC多为“冷肿瘤”，仅15% mismatch repair-deficient/microsatellite instability-high（dMMR/MSI-H）亚型对免疫检查点抑制剂（ICI）有持久响应，且50%转移性患者会产生获得性耐药，本研究识别出TAMs中驱动免疫抑制的关键基因，为改善免疫治疗效果提供新靶点；
克服TAM靶向治疗的局限性：现有TAM靶向策略（耗竭、抑制招募、重编程）存在非特异性或代偿性耐药风险，本研究发现的DPP7-CPT1A-TRIM25调控轴为精准靶向TAMs代谢重编程提供新思路；
明确CRC不良预后的生物标志物：DPP7⁺TAMs浸润密度可作为CRC患者独立预后指标，为临床预后评估提供新工具。
四、研究方法及目的（表格形式）
表1：生信分析方法及目的
| 分析方法 | 具体内容 | 核心目的 |
|---|---|---|
| 单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析 | 分析GSE178341、PRJNA748525数据集，含CRC及正常组织细胞 | 筛选TAMs特异性标志物及预后相关基因 |
| 转录组数据分析 | 下载TCGA-COAD/READ数据集，DESeq2标准化、差异基因分析 | 验证目标基因（DPP7）的临床相关性 |
| 功能富集分析 | GO、KEGG、Reactome通路分析（ClusterProfiler、GSVA包） | 探索目标基因调控的关键生物学通路 |
| 生存分析及 Cox 回归 | Kaplan-Meier 生存曲线、单/多因素 Cox 回归 | 明确DPP7⁺TAMs的预后价值及独立性 |
表2：临床样本验证方法及目的
| 实验方法 | 具体内容 | 核心目的 |
|---|---|---|
| 免疫荧光（IF）双染色 | DPP7与CD68共染，检测CRC及正常组织 | 验证DPP7⁺TAMs的存在及组织分布 |
| 免疫组化（IHC） | 检测CRC组织中DPP7、CD68、PD-L1表达 | 量化目标蛋白表达，关联临床预后 |
| 多色免疫荧光（mIF） | 检测DPP7、CD68、CD8、PD-1等共定位 | 分析DPP7⁺TAMs与免疫细胞的相互作用 |
| 飞行时间质谱流式（CyTOF） | 41种金属标记抗体检测新鲜CRC样本免疫细胞 | 解析DPP7⁺TAMs对TIME的重塑作用 |
表3：细胞实验方法及目的
| 实验方法 | 具体内容 | 核心目的 |
|---|---|---|
| 细胞培养与诱导 | THP-1诱导为巨噬细胞，BMDMs经肿瘤条件培养基（TCM）诱导 | 构建TAM样细胞模型 |
| 慢病毒转染 | 过表达/敲低DPP7、TRIM25、CPT1A | 验证目标基因的功能及调控关系 |
| 共培养实验 | TAM样细胞与CD8⁺T细胞共培养 | 检测DPP7⁺TAMs对CD8⁺T细胞功能的影响 |
| 代谢相关检测 | 油红O染色、游离脂肪酸（FFA）检测、ATP检测、氧消耗率（OCR）检测 | 评估FAO代谢活性及能量生成 |
| 蛋白相互作用实验 | Co-IP、Pull-down、免疫荧光共定位 | 验证DPP7与CPT1A、TRIM25的结合关系 |
| 泛素化实验 | 免疫沉淀结合Western blot检测CPT1A泛素化水平 | 阐明DPP7对CPT1A稳定性的调控机制 |
表4：动物实验方法及目的
| 实验方法 | 具体内容 | 核心目的 |
|---|---|---|
| 皮下移植瘤模型 | C57BL/6J、BALB/c-nu小鼠接种MC38细胞+shDPP7/shNC-BMDMs | 验证DPP7敲低对肿瘤生长的影响 |
| 肝转移模型 | 小鼠脾脏注射MC38细胞+shDPP7/shNC-BMDMs | 验证DPP7敲低对转移的抑制作用 |
| 抗PD-1联合治疗 | 皮下移植瘤/肝转移模型给予抗PD-1抗体 | 评估DPP7靶向与免疫治疗的协同效应 |
| CD8⁺T细胞耗竭 | 注射抗CD8抗体 | 验证CD8⁺T细胞在抗肿瘤中的关键作用 |
五、实验设计与结果逻辑解读
1. Figure 1：TAMs中预后相关标志物的筛选
设计逻辑：CRC的TIME中TAMs功能关键但调控基因不明，需通过单细胞测序筛选特异性标志物。首先解析CRC组织单细胞转录组，聚焦巨噬细胞与预后相关的差异基因，通过交集分析和LASSO回归筛选核心靶点。
实验/分析设计：
分析GSE178341数据集（64例CRC、36例正常组织，26617个细胞），通过t-SNE聚类得到12种细胞亚群，重点分析巨噬细胞的差异表达基因；
整合3个基因集：scRNA-seq鉴定的TAMs标志物、肿瘤vs正常组织巨噬细胞中上调基因、TCGA队列中预后不良相关基因；
经LASSO回归筛选出8个候选基因，以DPP7的回归系数最高，且在巨噬细胞中高表达。
- 结果：
巨噬细胞在肿瘤组织中富集吞噬作用、代谢调控、抗原呈递相关通路（Figure 1C），提示其功能发生显著重塑；
DPP7在巨噬细胞中高表达，在其他免疫细胞和实质细胞中低表达（Figure 1G、H），且CRC组织中DPP7表达显著高于正常组织；
-
确定DPP7为TAMs中核心候选基因，可能参与CRC预后调控。
2. Figure 2：DPP7⁺TAMs的临床预后价值验证
设计逻辑：筛选出DPP7后，需明确其在临床样本中的表达定位及与患者预后的关联，验证其作为生物标志物的潜力。
实验/分析设计：
对华东医院282例CRC患者样本进行IF双染色（DPP7+CD68），定义DPP7⁺TAMs；
量化DPP7⁺TAMs在肿瘤vs正常组织、转移vs非转移样本中的浸润密度；
结合IHC结果及TCGA队列数据，进行Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox回归。
- 结果：
DPP7与CD68在肿瘤组织中存在共定位（Figure 2A），DPP7⁺TAMs在肿瘤组织中浸润密度显著高于正常组织（Figure 2B），且转移患者中更高（Figure 2D）；
高DPP7⁺TAMs浸润的CRC患者总生存期（OS）显著缩短（Figure 2H），且DPP7与CD68共高表达患者预后最差（Figure 2J、M）；
-
多因素Cox回归证实，DPP7⁺TAMs浸润密度是CRC患者OS的独立预后因素（Table 1）。
3. Figure 3：DPP7⁺TAMs对免疫抑制微环境的调控作用
设计逻辑：明确DPP7⁺TAMs的临床价值后，需进一步探索其对TIME的影响，尤其是对免疫细胞亚群及功能的调控。
实验/分析设计：
对8例新鲜CRC样本进行CyTOF分析，解析DPP7⁺TAMs高/低浸润组的免疫细胞组成差异；
通过mIF检测DPP7⁺TAMs与CD8⁺T细胞、PD-1的共定位关系；
分析CD8⁺T细胞功能标志物（PD-1、TIM3、CTLA4等）的表达水平。
- 结果：
CyTOF聚类显示DPP7主要表达于TAMs（Figure 3A、B），高DPP7⁺TAMs组中CD8⁺T细胞、调节性T细胞（Tregs）、髓系来源抑制细胞（MDSCs）浸润显著增加（Figure 3D）；
高DPP7⁺TAMs组中CD8⁺T细胞的耗竭标志物PD-1表达显著升高（Figure 3E、F）；
mIF结果证实DPP7⁺TAMs浸润与PD-1⁺CD8⁺T细胞比例呈正相关（Figure 3G、H），提示DPP7⁺TAMs促进免疫抑制微环境形成。
4. Figure 4：DPP7⁺TAMs诱导CD8⁺T细胞耗竭的功能验证
设计逻辑：基于Figure 3的相关性分析，需通过体外共培养和体内动物实验验证DPP7⁺TAMs对CD8⁺T细胞功能的直接调控作用。
实验/分析设计：
体外构建TAM样BMDMs（经MC38细胞TCM诱导），构建DPP7敲低（shDPP7）和对照（shNC）细胞系；
将TAM样BMDMs与CD8⁺T细胞共培养，检测CD8⁺T细胞的PD-1表达及细胞毒性标志物（GZMB、IFN-γ）水平；
构建皮下移植瘤模型（C57BL/6J免疫competent小鼠和BALB/c-nu免疫缺陷小鼠），验证DPP7敲低对肿瘤生长的影响及CD8⁺T细胞的作用。
- 结果：
体外共培养中，shDPP7-BMDMs组CD8⁺T细胞PD-1表达降低，GZMB和IFN-γ表达升高（Figure 4D-F）；
体内实验中，shDPP7-BMDMs可显著抑制C57BL/6J小鼠肿瘤生长（Figure 4H），但对BALB/c-nu小鼠无显著作用（Figure 4I）；
敲低DPP7不影响CD8⁺T细胞浸润效率，但显著降低其PD-1表达（Figure 4J、K），且CD8⁺T细胞耗竭后shDPP7的抗肿瘤作用消失（Figure 4L），证实DPP7⁺TAMs通过诱导CD8⁺T细胞耗竭促进肿瘤进展。
5. Figure 5：DPP7通过促进脂肪酸氧化（FAO）诱导TAMs免疫抑制表型
设计逻辑：明确DPP7⁺TAMs的功能后，需探索其分子机制，聚焦代谢重编程（已知M2型TAMs依赖FAO供能）。
实验/分析设计：
对DPP7过表达的THP-1巨噬细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因及富集通路；
通过LC-MS/MS鉴定DPP7相互作用蛋白，结合代谢组学分析脂质代谢变化；
检测TG、FFA含量、ATP生成及氧消耗率（OCR），评估FAO活性；
检测M1/M2表型标志物（CD80、CD206、TLR2/4、VEGFA等）的表达。
- 结果：
RNA-seq及功能富集分析显示，DPP7过表达显著富集脂肪酸代谢、FAO相关通路（Figure 5B、C）；
DPP7过表达诱导TAMs呈现M2表型：M1标志物（TLR2/4、CXCL9/10）下调，M2标志物（CD206、VEGFA、IL10）上调（Figure 5D、E）；
-
代谢检测显示，DPP7过表达组TG、FFA含量降低，ATP生成增加，OCR升高（Figure 5I-L），证实DPP7促进TAMs的FAO活性。
6. Figure 6：DPP7通过结合CPT1A减少其泛素化降解增强FAO
设计逻辑：FAO的关键限速酶为CPT1A，需验证DPP7是否通过调控CPT1A功能影响FAO。
实验/分析设计：
通过Co-IP、Pull-down及免疫荧光共定位验证DPP7与CPT1A的相互作用；
利用CHX追踪实验检测CPT1A蛋白稳定性，MG132（蛋白酶体抑制剂）、氯喹（自噬抑制剂）明确降解途径；
通过泛素化实验检测DPP7对CPT1A泛素化水平的影响；
利用CPT1A抑制剂（Etomoxir）或过表达CPT1A，验证其在DPP7调控FAO及M2表型中的作用。
- 结果：
DPP7与CPT1A存在直接相互作用且共定位（Figure 6B-D），DPP7过表达可增加CPT1A蛋白水平但不影响mRNA水平（Figure 6E）；
CHX实验显示DPP7过表达延缓CPT1A降解，MG132可阻断该降解（Figure 6F、G），且DPP7过表达显著降低CPT1A泛素化水平（Figure 6H）；
-
Etomoxir可逆转DPP7过表达诱导的FAO增强、ATP生成增加及M2表型（Figure 6I、K-N），而CPT1A过表达可挽救DPP7敲低的表型（Figure 6J、K-N），证实DPP7通过稳定CPT1A促进FAO。
7. Figure 7：DPP7与TRIM25竞争性结合CPT1A抑制其泛素化
设计逻辑：明确DPP7稳定CPT1A后，需鉴定CPT1A的泛素连接酶，阐明DPP7的调控方式。
实验/分析设计：
通过LC-MS/MS鉴定CPT1A相互作用蛋白，结合UbiBrowser预测E3泛素连接酶，筛选TRIM25；
验证TRIM25与CPT1A的相互作用及对CPT1A泛素化、降解的影响；
检测DPP7对TRIM25-CPT1A结合的影响，明确竞争性结合关系。
- 结果：
TRIM25与CPT1A存在相互作用（Figure 7B-D），TRIM25过表达促进CPT1A泛素化及降解（Figure 7F、H），敲低TRIM25则相反（Figure 7E）；
DPP7与TRIM25无直接相互作用，但DPP7过表达可显著抑制TRIM25与CPT1A的结合（Figure 7I），且呈浓度依赖性（Figure 7J）；
-
证实DPP7通过竞争性结合CPT1A，阻断TRIM25介导的泛素化降解，稳定CPT1A蛋白。
8. Figure 8：DPP7敲低协同抗PD-1治疗改善CRC疗效
设计逻辑：基于上述机制，需验证靶向DPP7联合免疫治疗的临床潜力。
实验/分析设计：
构建CRC皮下移植瘤及肝转移模型，分组为：shNC-BMDMs+IgG、shDPP7-BMDMs+IgG、shNC-BMDMs+抗PD-1、shDPP7-BMDMs+抗PD-1；
检测各组肿瘤生长、转移负荷及TIME的变化（TAMs表型、CD8⁺T细胞浸润及耗竭状态）；
分析PD-L1表达水平，探索协同机制。
- 结果：
联合治疗组（shDPP7-BMDMs+抗PD-1）对皮下移植瘤生长（Figure 8B）及肝转移（Figure 8C）的抑制效果最显著；
联合治疗组TAMs呈现M1样表型：MHC-II、CD80表达升高，CD206表达降低（Figure 8D、E）；
联合治疗组肿瘤浸润CD8⁺T细胞数量增加，PD-1⁺CD8⁺T细胞比例降低（Figure 8F、G），且PD-L1表达升高（Supplementary Fig.9），提示DPP7敲低通过重塑TIME增强抗PD-1治疗敏感性。
9. Figure 9：机制示意图
- 核心逻辑总结：TAMs中DPP7与CPT1A竞争性结合，阻断TRIM25介导的CPT1A泛素化降解，增强FAO活性，促进TAMs向M2极化；M2型TAMs通过招募Tregs、MDSCs及诱导CD8⁺T细胞耗竭构建免疫抑制微环境，促进CRC进展；靶向DPP7可逆转该过程，协同抗PD-1治疗发挥抗肿瘤作用（Figure 9）。
六、研究总结
本研究通过多组学分析、临床样本验证及体内外实验，系统阐明了DPP7在CRC肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的功能及调控机制。首先，通过单细胞RNA测序筛选出TAMs中高表达的关键基因DPP7，证实DPP7⁺TAMs在CRC组织中高浸润，且与患者转移及不良预后密切相关，可作为独立预后生物标志物。其次，功能实验表明DPP7⁺TAMs通过诱导CD8⁺T细胞耗竭、招募免疫抑制细胞构建免疫抑制性肿瘤微环境（TIME）。机制上，首次发现DPP7与FAO关键酶CPT1A直接结合，竞争性抑制E3泛素连接酶TRIM25介导的CPT1A泛素化降解，增强TAMs的FAO代谢重编程，驱动M2极化。最后，体内实验验证敲低DPP7可显著逆转免疫抑制微环境，与抗PD-1治疗产生协同效应，抑制CRC生长及转移。该研究不仅揭示了DPP7-CPT1A-TRIM25调控轴在TAMs代谢重编程中的核心作用，还为CRC的免疫治疗提供了新的靶点及联合治疗策略，具有重要的临床转化价值。
