最新10分生信，单细胞+空转多组学进行中性粒细胞亚型分析，识别 CTCF+TAN，靶向CTCF改善免疫治疗疗效！

一、文章信息

• 发表杂志名称：International Journal of Biological Sciences
• 中文标题：综合分析方法鉴定出一种与结直肠癌发生相关的 CTCF + 肿瘤相关中性粒细胞亚型，可作为免疫治疗的生物标志物
• 英文标题：Comprehensive analytical approach identifies a subtype of CTCF+ tumor-associated neutrophils associated with CRC development and as a biomarker for immunotherapy
• 影响因子：10
• 发表日期：2025 年 8 月 16 日

二、研究概述

结直肠癌（CRC）是一种侵袭性强、异质性高的肿瘤，治疗选择有限。肿瘤相关中性粒细胞（TANs）在肿瘤微环境（TME）中具有多方面作用，其极化状态决定功能方向。本研究整合单细胞 RNA 测序、空间转录组学、批量 RNA 测序及体内外实验，鉴定出一种高表达 CCCTC 结合因子（CTCF）的 TANs 亚型（CTCF+ TANs）。该亚型富集于缺氧肿瘤区域，具有增强的迁移能力和 IL-1β 分泌功能，与患者不良预后及免疫治疗抵抗相关。机制上，CTCF 通过调控迁移和侵袭增强因子 1（MIEN1）的表达，促进 TANs 募集和迁移且不引发炎症。CTCF+ TANs 可抑制 T 细胞免疫、促进上皮 - 间质转化（EMT），推动 CRC 进展和转移。体内实验表明，靶向 CTCF-MIEN1-IL-1β 信号通路可改善免疫抑制微环境，提升抗 PD-L1 治疗效果，为 CRC 治疗提供了新的靶点和思路。

三、论文核心解读

3.1 研究目标与解决的实际问题

• 核心目标：揭示 TANs 在 CRC 进展中的异质性及功能机制，鉴定具有临床意义的 TANs 亚型及相关调控通路。
• 解决的实际问题：

1. 阐明 CRC 中 TANs 亚型的分类及肿瘤特异性亚型的特征，填补 TANs 异质性研究的空白。
2. 解析 CTCF+ TANs 促进 CRC 进展的分子机制，为理解 CRC 侵袭转移提供新视角。
3. 明确 CTCF+ TANs 与免疫治疗抵抗的关联，提供可靶向的治疗靶点，改善 CRC 患者治疗效果。

3.2 研究方法与目的（表格汇总）

表 1：生信分析方法及目的

表 2：实验验证方法及目的

3.3 实验 / 分析设计与结果解读

3.3.1 Figure 1：CRC 微环境细胞组成与 TANs 亚型鉴定

• 设计逻辑：通过 scRNA-seq 解析 CRC 发生过程中（正常黏膜→腺瘤→腺癌）的肿瘤微环境细胞构成，重点分析 TANs 的异质性，结合空间转录组学明确 TANs 亚型的分布特征。
• 实验 / 分析内容：

1. 对 3 名患者的 9 个样本进行 scRNA-seq，获得 47,210 个高质量细胞，鉴定出 8 大细胞谱系。
2. 对中性粒细胞进行亚群聚类，得到 Neu1、Neu2、Neu3 三个亚型，分析各亚型的基因表达特征。
3. 结合空间转录组数据，映射 TANs 亚型在肿瘤组织中的分布，通过伪时间分析探索其分化轨迹。

• 结果：

1. 恶性组织中中性粒细胞、B 细胞和髓系细胞比例升高，HE 染色显示中性粒细胞浸润随 CRC 进展逐步增加。
2. Neu2 亚型主要来源于癌组织，高表达核糖体功能和迁移相关基因，是肿瘤特异性 TANs 亚型。

3. 空间分布上，Neu2 富集于肿瘤恶性区域，伪时间分析显示其分化路径为 Neu3→Neu1→Neu2，且 Neu2 高表达 N2 型 TANs 标志物（ARG1、VEGFA 等），具有促肿瘤表型。

   
   

3.3.2 Figure 2：MIEN1 介导 Neu2 迁移的非炎症机制

• 设计逻辑：基于 Neu2 亚型的差异表达基因分析，聚焦 IL1B 和 MIEN1，验证 MIEN1 在 Neu2 迁移中的作用及是否依赖炎症通路。
• 实验 / 分析内容：

1. 通过免疫荧光验证 MIEN1 与中性粒细胞标志物 CD66b 的共定位。
2. 构建 MIEN1 过表达（oe-MIEN1）和敲低（sh-MIEN1）的 HL60 细胞模型，检测细胞增殖、核糖体密度、伪足形成及迁移能力。
3. 检测 MIEN1 对炎症相关分子（NLRP3、IL-1β）的影响。

• 结果：

1. MIEN1 与 CD66b 在 CRC 组织中高共定位，且随肿瘤进展表达升高。
2. MIEN1 过表达可增强 HL60 细胞增殖、核糖体生物合成及伪足形成，促进其向 CRC 细胞迁移；敲低则反之。

3. MIEN1 介导的迁移不影响 NLRP3 激活及 IL-1β 分泌，证明其通过非炎症机制发挥作用。

3.3.3 Figure 3：CTCF 是调控 Neu2 表型的关键上游因子

• 设计逻辑：通过转录因子预测筛选 Neu2 表型的上游调控因子，验证 CTCF 对 MIEN1 的调控作用及在 Neu2 功能中的核心地位。
• 实验 / 分析内容：

1. 整合 7 个转录调控数据库预测 MIEN1 的上游转录因子，通过 JASPAR 分析 CTCF 与 MIEN1 启动子的结合位点。
2. 采用双荧光素酶报告实验、ChIP-qPCR 验证 CTCF 与 MIEN1 的直接结合及转录调控关系。
3. 构建 CTCF 过表达和敲低细胞模型，检测对 MIEN1 表达、中性粒细胞功能（增殖、迁移、IL-1β 分泌）的影响。
4. 利用临床样本多色免疫荧光验证 CTCF-MIEN1-IL-1β 信号在肿瘤组织中的表达。

• 结果：

1. CTCF 是 MIEN1 的关键上游转录因子，可直接结合 MIEN1 启动子并激活其转录。
2. CTCF 过表达可增强中性粒细胞增殖、核糖体功能及迁移能力，促进 IL-1β 分泌，敲低则逆转这些表型。

3. 临床样本中，CD66b+CTCF+MIEN1+ triple 阳性细胞在 CRC 原发灶和肝转移灶中富集，正常组织和外周血中极少存在。

   
   

3.3.4 Figure 4：缺氧通过 HIF-1α-CTCF 轴诱导 Neu2 表型

• 设计逻辑：基于 Neu2 在肿瘤缺氧区域的富集特征，探索缺氧环境对 CTCF-MIEN1-IL-1β 通路的调控作用及分子机制。
• 实验 / 分析内容：

1. 利用空间转录组数据分析肿瘤组织中缺氧信号与 Neu2 的共定位关系。
2. 在缺氧（1% O₂）和常氧（21% O₂）条件下培养 HL60 来源 TANs，检测 CTCF-MIEN1-IL-1β 通路分子表达。
3. 敲低 HIF-1α，验证其对 CTCF 表达及 Neu2 表型的影响。
4. 通过 CTCF 过表达 / 敲低实验，明确 CTCF 在缺氧诱导 Neu2 表型中的必要性。

• 结果：

1. Neu2 亚型与肿瘤缺氧区域高度共定位，Neu2 细胞的缺氧评分显著高于 Neu1 和 Neu3。
2. 缺氧条件下，CTCF、MIEN1、Pro-IL-1β 及成熟 IL-1β 表达升高，IL-1β 分泌增加。
3. HIF-1α 敲低可抑制缺氧诱导的 CTCF 表达及 Neu2 表型（迁移增强、核糖体生物合成增加）。

4. 常氧下 CTCF 过表达可模拟 Neu2 表型，缺氧下 CTCF 敲低可逆转 Neu2 表型。

3.3.5 Figure 5：Neu2 通过 CTCF-MIEN1-IL-1β 通路促进 CRC EMT 及肿瘤生长

• 设计逻辑：探究 Neu2 对 CRC 细胞 EMT 进程的影响，验证 CTCF-MIEN1-IL-1β 通路在该过程中的作用，结合动物实验确认体内功能。
• 实验 / 分析内容：

1. 利用空间转录组分析 Neu2 与 CRC 细胞 EMT（部分 EMT/pEMT、完全 EMT/cEMT）的关联。
2. 构建 Neu2 与 CRC 细胞的共培养体系，检测 EMT 标志物（E - 钙粘蛋白、N - 钙粘蛋白等）的表达变化。
3. 通过 Transwell 侵袭实验、伤口愈合实验、球形成实验验证 Neu2 对 CRC 细胞侵袭、迁移及干细胞样特性的影响。
4. 建立原位 CRC 小鼠模型，评估 CTCF 过表达 / 敲低 TANs 对肿瘤生长的影响。

• 结果：

1. Neu2 与 CRC 细胞的 pEMT 进程高度相关，Neu2 富集区域的 pEMT 评分显著升高。
2. CTCF 过表达 TANs 可抑制 E - 钙粘蛋白表达，增强 N - 钙粘蛋白、Tenascin C 等 EMT 标志物表达，促进 CRC 细胞侵袭、迁移及干细胞样特性；MIEN1 敲低或 IL-1β 中和可逆转该效应。
3. 体内实验中，CTCF 过表达 TANs 可促进肿瘤生长和 TANs 浸润，MIEN1 敲低或 IL-1β 中和可减弱这一作用。

• 设计逻辑：基于 pEMT 与肿瘤转移的密切关联，探究 Neu2 在 CRC 肝转移（CRLM）中的作用。
• 实验 / 分析内容：

1. 对 CRLM 样本进行空间转录组分析，检测 Neu2 与 pEMT 标志物的共定位。
2. 建立 CRC 肝转移小鼠模型（脾内注射 MC-38-luc 细胞），输注不同处理的 ER-Hoxb8 来源中性粒细胞。
3. 通过生物发光成像、组织学分析评估肝转移灶数量和大小。
4. 多色免疫荧光验证 Neu2 与 pEMT 标志物在肝转移灶中的空间关联。

• 结果：

1. CRLM 样本中，Neu2 与 pEMT 标志物在转移灶区域高度共定位。
2. CTCF 过表达中性粒细胞可显著增加肝转移灶数量和大小，MIEN1 敲低或 IL-1β 中和可部分逆转该效应。
3. 肝转移灶中，Neu2 + 细胞周围富集 N - 钙粘蛋白 / Tenascin C 双阳性的 pEMT 细胞。

• 设计逻辑：探索 Neu2 对肿瘤微环境中基质细胞（癌相关成纤维细胞 CAFs、肿瘤相关巨噬细胞 TAMs）的调控作用，揭示其重塑 TME 的机制。
• 实验 / 分析内容：

1. 构建 Neu2 与成纤维细胞的共培养体系，检测 CAFs 标志物（α-SMA、FAP 等）的表达。
2. 检测 Neu2 对成纤维细胞线粒体功能、糖代谢的影响（Seahorse 分析、乳酸检测等）。
3. 通过非接触共培养实验，验证 Neu2 对 TAMs 极化（M1/M2）的影响。
4. 临床样本空间分析，明确 CTCF+ TANs 与 CAFs、TAMs 的空间关联。

• 结果：

1. CTCF 过表达 TANs 可诱导成纤维细胞活化为 CAFs，增强 α-SMA、FAP、COL1A1 等标志物表达，IL-1β 或 NAMPT 中和可逆转该效应。
2. 活化的 CAFs 表现为线粒体功能受损（膜电位降低、结构碎片化）、糖酵解增强（ECAR 升高、乳酸分泌增加）。
3. CTCF 过表达 TANs 可促进 TAMs 向 M2 型极化（CD163、SPP1 表达升高）。
4. 临床样本中，CTCF+ TANs 与 CAFs、TAMs 在空间上紧密聚集，形成促肿瘤微环境。

• 设计逻辑：分析 Neu2 对肿瘤免疫微环境的影响，重点探究其对 CD8+ T 细胞浸润及功能的调控作用。
• 实验 / 分析内容：

1. 结合 TCGA-CRC 数据，分析 Neu2 水平与 CD8+ T 细胞浸润的关联。
2. 空间转录组分析 Neu2 富集区域的 T 细胞细胞毒性和耗竭标志物表达。
3. 检测 Neu2 对 PD-L1 表达及 CD8+ T 细胞与 PD-L1 + 细胞空间关联的影响。
4. 共培养实验验证 Neu2 对 CD8+ T 细胞活化（CD69、CD25 表达）的影响。

• 结果：

1. 高 Neu2 水平的 CRC 组织中 CD8+ T 细胞浸润显著减少。
2. 距离 Neu2 富集区域越近，T 细胞细胞毒性标志物表达越低，耗竭标志物表达越高。
3. CTCF 过表达 TANs 可增强 PD-L1 表达，促进 CD8+ T 细胞与 PD-L1 + 细胞的空间靠近，抑制 CD8+ T 细胞活化（CD69+、CD25 + 细胞比例降低）。
4. MIEN1 敲低、IL-1β 中和或 NAMPT 中和可逆转 Neu2 介导的免疫抑制效应。

• 设计逻辑：验证 Neu2 对免疫治疗的影响，评估靶向 CTCF-MIEN1-IL-1β 通路联合抗 PD-L1 治疗的效果。
• 实验 / 分析内容：

1. 建立原位 CRC 和肝转移小鼠模型，给予抗 PD-L1 治疗，同时输注不同处理的中性粒细胞。
2. 通过生物发光成像、组织学分析评估肿瘤负荷和转移情况。
3. 总结 CTCF+ TANs（Neu2）在 CRC 进展中的作用机制及调控网络。

• 结果：

1. CTCF 过表达中性粒细胞可显著削弱抗 PD-L1 治疗的疗效，表现为肿瘤负荷增加、肝转移灶增多。
2. MIEN1 敲低或 IL-1β 中和与抗 PD-L1 联合治疗，可恢复抗 PD-L1 的治疗效果，显著降低肿瘤负荷和转移风险。

3. 机制总结：Neu2 通过 CTCF-MIEN1-IL-1β 通路，促进 EMT、基质细胞活化、免疫抑制，最终推动 CRC 进展和免疫治疗抵抗。

   
   

四、研究总结

本研究通过多组学联合分析及体内外实验，首次鉴定出一种富集于 CRC 缺氧区域的肿瘤特异性 TANs 亚型 ——CTCF+ TANs（Neu2），系统阐明了其在 CRC 进展中的关键作用及调控机制。研究发现，缺氧环境通过 HIF-1α 激活 CTCF 转录，CTCF 进一步调控 MIEN1 表达和 IL-1β 分泌，形成 CTCF-MIEN1-IL-1β 信号轴，驱动 Neu2 的迁移、促 EMT、基质细胞活化及免疫抑制功能，最终促进 CRC 生长、转移和免疫治疗抵抗。临床样本验证显示，CTCF+ TANs 在 CRC 原发灶和肝转移灶中特异性富集，与患者不良预后相关。体内实验证实，靶向该信号轴可改善肿瘤免疫微环境，增强抗 PD-L1 治疗效果。该研究不仅揭示了 TANs 异质性在 CRC 中的重要意义，还为 CRC 的精准治疗提供了新的生物标志物和治疗靶点，为克服免疫治疗抵抗提供了潜在策略。胰腺癌谷氨酰胺代谢与 CD8 T 细胞及免疫治疗