当我们做到荧光定量实验时候，普遍采用操作简便的2–ΔΔCT 法。
前提条件：
1. 使用2–ΔΔCT 法之前，必须验证目标基因和参照基因的扩增效率。目标基因和参照基因扩增效率都接近100%， 且相互间效率偏差在5% 以内。
计算方法：
首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的CT 值归一目标基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)
ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校准样本的ΔCT 值归一试验样本的ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后，计算表达水平比率：
2–ΔΔCT = 表达量的比值
计算模板建立
而现在我们现在用的这款仪器QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System是无法计算的，所以需要自己手动计算，理解原理更容易操作。当然，此公式适合于所有2–ΔΔCT 法的荧光定量。
经我修改后计算模板：
Quantitative PCR calculation template for QuantStudio(TM) 7 Flex System_J.F.XIE(均值法) .xls
https://pan.baidu.com/s/1qiubuZxm0y_3F6VYP0obJg
Extract code：hybr
案例展示
以吉玛生物公司试剂说明书案例为例，来计算 microRNA 相对于 U6 snRNA 的表达比率。
运用计算模板，只需对应输入数据，即可自动计算出公式，结果如下：
值得注意几点：
1. 数据修正：三个重复，如果CT值差异在0.2以外，则应剔除掉，所得结果均值会更加好。
2. 数据录入：我们在做PCR时候，已经排好版面，所以再挑出这些基因及内参时候，需要花费精力。简单点，可以将结果复制粘贴到新的excle文档，然后“筛选”，依次筛选出不同模板的“内参”、“靶标基因”的CT值，如下图筛选出的是EGFP对照处理组内参rpl32的CT值。
3. 对应：做定量时候，同一模板做基因，又检测内参，所以关系是一一对应，所以在录入时候，一定要对应准确，每个孔都有Well Position，结合着384孔板来看，强烈建议在做排版设计之初，就做到简洁、对称、明了，便于后续分析。
如果在下机前，有部分孔扩增有问题，如双曲线，不要“剔除”，可以直接将其记录下来或者清空这个孔的CT（不是改为0），因为一旦“omit”之后，我们后续筛选时候，导致数据不对称，会比较麻烦，容易出错。
4. 计算表达值时候，会有一个生物重复做归一化，即2的0次方为1，案例中的calibrator。这个自己可以选，我习惯将排版的最开始的那一个做归一。
如果你想将所有表达基因，都可以展示在一张图片上，那所有值应该都与这个归一化值做比较。
可以看到，Well Position是比较整齐的，依次为GHIIJK，当筛选基因时候，也会一一对应，不会出错。
