这一篇是张泽民老师团队发在cell上的文章，包括了196个新冠病人，284个样本，1462702个细胞的单细胞测序。是关于新冠最大规模的单细胞测序。

RESULTS

1. COVID-19 单细胞测序数据的整合分析

该研究一共纳入196个患者/正常对照，获得284个样本（包括了外周血、肺泡灌洗液和痰液样本）。过滤后一共得到1462702个细胞（平均UMI：4835，平均基因数：1587）。这些细胞分为64个群。
Fig1C和D查看了所有细胞群主要存在于哪种样本和哪个时期的样本中

分析流程：

• 过滤标准：
  PBMC：UMI>1000 & gene>500 & percent.mt<10%
• 双细胞去除（分组织进行）：UMI和gene数+Scrublet
  1. PBMC：UMI < 25000 & gene<5000
  2. 肺泡灌洗液和痰液：UMI< 70000 & gene<7000
  3. Scrublet：Doublet Rate=ncol(pbmc)*8*1e-6
  被预测为双细胞&doubletScore大于0.25的细胞被去除。
• 细胞注释：参考Table S2⚠️
• Nornamlization和Scale：scran包实现
• 批次矫正：Harmony
  先每个样本单独计算了高变基因，然后整合了1500个共有的高变基因，并删除了线粒体、核糖体和免疫球蛋白基因，随后使用Harmony进行批次矫正。we calculate a PCA matrix with 20 components using such informative genes and then feed this PCA matrix into HarmonyMatrix() function implemented in R package Harmony. We set sample and dataset as two technical covariates for correction with theta set as 2.5 and 1.5, respectively.
• 分群和寻找marker基因：scanpy
  第一次分群：resolution=0.3
  第二次分群：resolution=0.3 to 1.5
• 这里又去了一次双细胞（表达两种细胞marker的细胞被去除），表达HBA，HBB和HBD的细胞（红细胞）也被去除。

2. Association of patient age, sex, COVID-19 severity, and stage with PBMC compositions

这一部分主要是看各种免疫细胞亚型的比例变化和病情严重程度及性别、年龄等的相关性。

3. Association of patient age, sex, COVID-19 severity, and stage with the diversity of B and T cell repertoires

免疫组库分析，见：scRepertoire

4. SARS-CoV-2 RNAs detected in multiple epithelial and immune cell types

Fig 4A-B：从重症新冠患者的6个 BALF 和2个 sputum 样本中，作者从ciliated, secretory, and squamous 上皮以及多种免疫细胞包括neutrophils, macrophages, plasma B cells, T cells, 和 NK cells的3085个细胞中检测出了病毒RNA。
Fig 4C： Interestingly, immune cells harbored even more viral RNA sequences than epithelial cells
Fig 4D, E： 作者查看了新冠受体在这些细胞中的表达。发现ACE2和TMPRSS2在部分上皮细胞中表达，而免疫细胞则不表达这些受体。随后作者检测了最近被报道与SARS-CoV-2 entry有关的host factors：BSG 和 TFRC，发现它们的表达与不同细胞中病毒RNA的丰度相关。(moderate symptoms的新冠患者的肺泡灌洗液和痰液中则没有检出病毒)

病毒感染结构细胞主要是通过ACE2和TMPRSS2，感染免疫细胞主要是通过BSG 和 TFRC？

Fig 4F：Since interferon-stimulated genes (ISGs) are typically associated with viral RNA sensing，作者也看了一下干扰素相关基因的表达，和病毒感染情况基本一致（C图）。干扰素的表达在病毒阳性的细胞中也比病毒阴性的细胞显著要高（附件）。
Fig 4G：We then examined the detection rates of different SARS-CoV- 2 genes in these cells. 在这个队列中，SARS-CoV-2-RNA阳性的免疫细胞在不同研究中心（包括了3'和5'测序）都被检测到。由于冠状病毒的特征是subgenomic transcription亚基因组转录，而且SARS-CoV-2是单股正链RNA病毒，因此在发生亚基因组转录的情况下，接近3'端的基因应该比5'端的基因检出率更高。In fact, both 10x 5' and 3; sequencing data demonstrated a 3'-enriched detection pattern along the SARS-CoV-2 genome in viral-RNA- positive cells, reminiscent of subgenomic transcription, in contrast to those cells without detectable SARS-CoV-2 RNA (G). Since both 5' and 3' sequencing platforms detected consistent patterns along the genome, the positive and negative strands of the SARS-CoV-2 genome (at least the sub- genomes) likely both exist in these cell types, implicating active viral replication and transcription.

冠状病毒的复制过程中会产生不同长度的亚基因组mRNA转录本，传统的标准RNA测序技术由于生成的读长短，且依赖扩增产生互补DNA（cDNA）序列，无法产生能够代表RNA病毒基因组或亚基因组长度的mRNA序列。

Fig 4H：免疫组化验证了一下

5. Transcriptomic differences between SARS-CoV-2-RNA- positive and negative epithelial cells and the potential impact on cell-cell interactions

The presence of SARS-CoV-2 RNA in different epithelial cells seemed to be associated with additional transcriptomic changes.
Fig 5A, B：在鳞状上皮细胞，SARS-CoV-2-RNA阳性的细胞有一些基因显著表达上调，如NT5E, CLCA4 和 SULT2B1。这些基因富集到的通路包括‘response to virus,’ ‘response to type I interferon,’ 和 ‘response to hypoxia’等。
Fig 5C：而在ciliated epithelial cells，病毒阳性和阴性的转录改变较小。有一些基因(50个)在三种上皮细胞感染病毒后都出现了变化。

在A图中我们观察到一些基因包括ANXA1在感染了病毒的鳞状上皮出现了显著上调。ANXA1通过与formyl peptide receptors（甲酰基肽受体）结合参与调节中性粒细胞的炎症反应，这使得作者想要去进一步探究病毒阳性和病毒阴性细胞的互作。
Fig 5D：作者使用CSOmap构建了severe患者和moderate患者的病毒阳性和阴性细胞的三维互作网络。
Fig 5E-G：和病毒阴性细胞相比，ciliated细胞感染病毒后与自身的互作下降，而鳞状上皮感染病毒后与自身的互作上升。
Fig 5H：In severe patients, viral-RNA-positive squamous cells showed significant interactions with neutrophils and macrophages via the ANXA1-FPR1 and S100A9/A8-TLR4 axes.
Fig 5I：Neutrophils and macrophages exhibiting high interact- ing potentials with viral-RNA-positive squamous epithelial cells were also prone to be SARS-CoV-2 RNA positive

关于细胞中病毒基因组的检测，方法比较常规

6. Megakaryocytes and monocyte subsets as critical peripheral sources of cytokine storms

We next sought to investigate the potential sources of cytokine production.
Fig 6A：作者首先计算了所有细胞的炎症评分和细胞因子评分，发现七种细胞类型 (3种单核细胞: Mono_c1-CD14-CCL3, Mono_c2-CD14-HLA-DPB1, Mono_c3-CD14-VCAN, 3种 T cells: T_CD4_c08- GZMK-FOShigh, T_CD8_c06-TNF, and T_CD8_c09-SLC4A10和1种megakaryocytes) 的炎症评分和细胞因子评分显著升高，提示它们是细胞因子风暴的主要来源。见：Seurat的打分函数AddMouduleScore
Fig 6B：The proportion of these hyper-inflammatory cell sub- types in PBMCs showed different enrichment patterns in patient groups.

7. Interactions of hyper-inflammatory cell subtypes in lung and peripheral blood

主要用了iTALK来分析细胞互作