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诺如病毒（Norovirus）属杯状病毒科（Caliciviridae），正链单股RNA，基因组长度约 7.5–7.7 kb，带多聚腺苷尾（poly-A）。基因组典型地分为 3 个 ORF：
ORF1：非结构蛋白多聚体（含 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 RdRp 等酶）
ORF2：主要衣壳蛋白 VP1
ORF3：次要衣壳蛋白 VP2
ORF1/ORF2 之间存在重叠与“连接区”，为同源重组热点
基因群与宿主：目前公认 10 个基因群（GI–GX）；其中人群主要检出 GI、GII、GIV、GVIII、GIX（原 GII.15）
为什么要进行
双分型
双分型原则：
VP1（ORF2）→ genotype（型别）
RdRp（ORF1）→ P-type（聚合酶型）
报告时按 “genotypeP−typeP-typeP−type” 书写，例如 GII.4 SydneyP31 。这样能同时反映衣壳与聚合酶的系统发育背景，并能识别重组体（如 VP1 与 RdRp 分属不同谱系）
测序方法的选择
01
探针捕获的全基因组测序（WGS，Hybrid-capture）
病毒抽提核酸进行逆转录后，以 SureSelect 等杂交捕获富集诺如病毒核酸，再上机；在 Ct 10–43 的样本上可获得高比例 。on-target与近全长覆盖，适合 ORF1/2/3 全景分析与重组判读。
测序后可得到完整的基因组文件fasta
我用的是illumina 的 VSP2（多病源捕获试剂盒）
得到全部的基因组当然最好！！！
02
无靶向宏基因组测序（shotgun mNGS）
之前的公众号文章中有写过，大家自行搜索，适合CT20以内
03
经典 PCR 扩增后测序
各扩增一段 RdRp 片段 与 VP1 片段，分别判定 P-type 与 genotype。常用引物：
MON 系列（如 MON431/432/433/434）：布局在 RdRp 的“Region A”，用于 RdRp 片段扩增与分型。
G1/G2 SKF–SKR：布局在 VP1 的“Region C”，GI 用 G1SKF/G1SKR，GII 用 G2SKF/G2SKR，是最常用的衣壳分型引物。
这种扩增后的产物大概有600bp左右，用于分型足够。但后续测序方法有以下选择
一代测序
直接可测得全长600bp左右的fasta文件
二代测序
与常规样品测序并无不同，主要是成本问题：① 成本主要集中在建库方面②600bp达到测序深度1000X,一个3G的盒子理论上可以测50个样品
难点，二代测序后组装
推荐方法如下：
spades -rnavirus 组装获得contig
在contig文件中寻找kmer数大于400的那一段contig（一般只有一个，600bp左右） 就是我们想要的的这一段测序结果（但不完全正确哦）
拿这一段在网站分型，获得预先分型https://mpf.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/
4.获取该分型参考基因组，所由基因组在我评论区有下载链接（包括fasta和样品信息表）
5.拿参考基因组对fastq进行有参拼接，获得正确fasta(我有亲自试过，可以在fatsa里找到我们初始的引物)
分型方法
1.网站
之前我有介绍过https://mpf.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/
但是网站是国外的，自己看着办
2.自己建树
拿我评论区的所有fasta文件，用mafft-->fasttree-->figtree进行建树，看和谁最近缘，你就是谁
3.NCBI Blast
逻辑和自己建树差不多,直接blast，但是要找到相似度最高的基因组的分型结果
创作不易
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