今天分享最近发表的另外一篇文献，还是棉花棉纤维研究的，最近棉花的单细胞文章还真是多，扎堆发表了。
棉纤维的重要性，我就不多做叙述了，我也查百度，就不粘贴了。circadidan clock（生物钟），在模式植物拟南芥里面研究的很多，以前我们实验室做的也很多，经常听实验室的小伙伴讲。生物钟对植物的发育和生理功能具有重要的调节作用，比如控制气孔开闭，下胚轴伸长，开花时间，光响应等等。然而生物钟在棉花纤维发育中的作用还较少报道。
==========实验设计=========
还是先看别人的实验设计。
该研究建立了一种从棉花胚珠外被（OI：outer integument）制备原生质体细胞的酶解方案（PTED，Partial Tissue Eenzymatic Digestion）（下图a）。然后使用PTED的方法，成功获得陆地棉徐州142及其无绒突变体（fl）开花前后（-2至+2 DPA）的胚珠外珠被的原生质体，并进行单细胞转录组和染色质开放性测序。
=========实验结果========
1. 胚珠外珠被中鉴定出纤维细胞
通过单细胞测序，作者在野生型（WT）和突变体（fl）中共获得了18064和21389个细胞，每个样品是2个重复。然后就是常规的单细胞相关的聚类，降维等分析。从上图d中，也可以看出消除了批次效应。上图b就是WT和fl的UMAP展示。从图中可以看出，可以被分成5大类。对比WT和fl，可以看出，两个在C3上有明显的差异（上图b和c）。
下面，作者开始鉴定每个cluster的marker基因，数量如上图e，f，g所示。针对C3中的marker基因，作者分别利用原位杂交，GUS reporter以及定量PCR验证了：GaMYB2，GhHD1，GhFLA1，GbPDF1，GhABP19/20，GhACTIN1等基因，例如上图h中的XTH基因。
为了进一步验证C3 cluster是纤维细胞，作者进一步用激光显微切割并测序尝试去捕获1 DPA时期的纤维细胞（上图i）。然后，作者把UMAP中的细胞与LCM中的纤维细胞进行相关性分析，发现C3簇中的细胞与纤维细胞具有最高的相关性（上图j）。这些结果表明C3聚类代表棉花纤维细胞。同时，作者还比较了5 DPA时期纤维细胞的以往发表的RNA-seq，也发现和C3类有很强的相关性，再次确认了C3是棉纤维细胞。（我在想需要这么复杂去证明吗？不是有C3的marker基因，也不是做了marker基因的定位验证了吗？）
2. 棉纤维发育轨迹分析以及关键节点鉴定
然后，也是单细胞分析中的常规分析，利用monocle3做了分化轨迹分析，结果如下图a和b（一个是不设root，一个是设C1为root）。主要是根据以往发表的RNA-seq来进行判断（下图c），发现C1属于早期表达的，所以才把C1设置成了root。下图d中highlight了4个基因。下面就是挖掘在关键分化节点上的重要基因了，下图e，f，g，h所示。发现在C3中富集的这些分化基因大多数与表皮了，表皮毛的发育相关。
3. 棉纤维细胞特异表达的小肽可以抑制棉纤维的发育
这个章节很像是倒着讲故事的，估计是实验室积累的结果，和单细胞相结合了吧，不然不清楚为何过度到了小肽身上，过度到RALF还能说一下。作者文中叙述的逻辑是因为RALF基因在C3细胞中特异表达（下图a），这个基因又有2个家族RALF1和RALF2（下图b）。作者通过添加合成的外部肽段来观测棉纤维的表型。发现RLAF1可以显著的已知纤维的发育，但是GALF2的效果有限（下图c）。以往在拟南芥研究发现，RALF家族的肽段可以通过通过抑制拟南芥质膜（PM）上的H+-ATP活性而导致质外体快速碱化。所以，作者使用来自GhRALF1和GhRALF2的两种代表性肽进行质子泵活性测定（下图d），但是我不确定这个实验对于这个文章的意义，当然我对于RALF的机理研究也不太熟悉。
然后就是常规的分析，既然高表达的小肽GhRALF1在体外实验中显示出对纤维早期生长的显著抑制作用，那么就测试它为啥能抑制了？紧接着，作者做了RLAF1小肽处理和未处理的RNA-seq。鉴定出了差异基因（下图e），从功能的角度进行了阐述，并给出了一个总结模型（下图f）。
4. 生物钟对于棉纤维发育的调控
考虑到生理效应是快速和暂时的（上图d，e），作者猜想GhRALF1可能在纤维细胞中表现出时间周期上的差异表达，以避免对原代纤维细胞生长的长期抑制（其实我没看懂这个假设和出发点）。为了测试这个假设，作者对RALF1以及纤维长度，以及ph在3天的时间里面，没隔4小时都进行了检测。结果发现：RALF1表现出了非常规律的节律特征，在1天中有2个明显的peak（下图a）。
作者也在每个时间点统计了棉纤维的延伸情况，发现：早期纤维生长（0至2 DPA）遵循典型的每日循环模式，每天有两次快速伸长（下图b）（其实，我还看不出来，不标红圈圈，我都不太能看出作者说的结果）。有趣的是，这两个快速伸长期与纤维细胞每天两次的质外体酸化（pH值下降）完全匹配（下图c）（8-16h小时也有更明显的下降，不知道为啥不阐述），这表明早期纤维细胞的节律性细胞扩张也遵循酸生长理论。
为了揭示背后的机制，作者对不同的关键时间点进行了36个不同样品的RNA-seq（下图d）。然后从中鉴定除了29282个可能受节律影响的关键基因（下图e），这些基因可以进一步的分为4类，并对每个类进行了功能富集分析，例如下图f是N1类的富集结果。进一步的对比WT和fl鉴定出了25个差异表达的生物钟基因，并选取了其中的几个进行了PCR的验证，以及一直在光照处理下的验证，从而从侧面证实了这些基因的准确性，也说明这些基因可能参与了对于棉纤维的调控（下图h和i）。
5. TCP motif和TCP-like motif调节棉纤维细胞的线粒体能量代谢和蛋白质翻译
接着，作者试图了解染色质水平上调节纤维细胞昼夜节律生长的决定因素。所以，作者对同样的样品又进行了scATAC测序。结果检测到了8992和13615个细胞核。鉴定到了216160个peak。
然后作者通过比较WT和fl，尝试去鉴定纤维细胞中特异的这些peak（文中定义了k-mer）（下图a）。结果鉴定到了590个特异的kmer，其中404个抑制的和186个促进的（下图b）。404个负向作用的kmer中，作者又发现显著富集G-box motif（下图c），这个motif已比证明可以在生物钟基因PRRpromiter区域富集。二在186个正向的kmer中发现明显富集TCP motif和TCP-like motif（下图d），并且大量在C3簇中特异表的marker基因都含有这个motif（下图e）。而这些富集这个motif的基因GO分析结果表明大部分是与线粒体以及蛋白翻译相关（下图f）。
作者下面分析了所有的TCP转录因子，发现一些member，例如TCP7，TCP14， TCP21在C3簇中特异表达。通过gel shift assay，作者确认了TCP14中可以和TCP motif和TCP-like motif相结合（下图g）。PCR结果表明这个TCP14也明显受生物钟的影响（下图h）。
作者接着分析了TCP的靶标基因，发现很多靶标基因在WT中也明显受生物钟的调控，但是fl中则没有这个现象（下图i）。并且通过测量ribosome profiling和ATP也发现出现节律的特征（下图k）。
基于上述发现，作者提出了一个棉纤维早期生长的节律调控模型。在棉纤维细胞中，核心节律器（生物钟，Clock Oscillators）通过控制棉纤维细胞特异性表达的基因（所谓纤维特异性的生物钟控制基因，Fiber-specific clock controlled genes，CCGs），以节律性地调控线粒体能量，核糖体翻译，生长素响应等多个生理过程，从而控制棉纤维细胞的生长（下图）。
