2022年6月，北得克萨斯州大学、橡树岭国家实验室在 Plant Cell（IF=12.085）在线发表了题为“ Proteomic and metabolic disturbances in lignin-modified Brachypodium distachyon ”的研究论文。这项研究主要采取“代谢组+蛋白组”分析的策略，那么人家是如何将蛋白组加代谢组这类常见的实验组合发到12+分的呢？今天我就给大家详细介绍一下。
木质素是植物细胞壁的酚类多聚体，在调节植物生理和新能源应用方面具有重要作用。有证据表明禾本科植物存在其他木质素合成方式。该研究通过构建若干木质素合成基因敲低系材料，结合表型鉴定、代谢组 + 蛋白质分析、同位素标记等实验，为了解二穗短柄草木质素代谢机制提供深入认识。
一、文章实验设计
1. 构建 RNAi 株系
利用RNAi技术分别下调5个二穗短柄草木质素合成基因PAL2、PTAL1、C4H1、C3’H1、HCT1。
2. 测定木质素变化
（1）荧光显微镜观察细胞结构。
（2）Wiesner法木质素染色。
（3）硫醇酸解+GC–MS测定木质素单体含量。
（4）乙酰溴法测定木质素含量。
3. 测定代谢变化
（1）靶向代谢组 LC–MS/MS 定量苯丙烷途径的中间产物。
（2）非靶向代谢组鉴定差异积累的初级、次级代谢物。
4. 鉴定木质素合成酶
从TAIR下载拟南芥木质素合成基因家族，利用Phytozome的BLAST搜索二穗短柄草中的同源基因。从BAR下载二穗短柄草的基因表达数据用于注释木质素合成酶的表达水平。
5. 蛋白组分析
测序、蛋白鉴定、表达定量、鉴定差异表达蛋白。
6. 解析新的合成途径
以13C9-Phe和13C9-Tyr同位素饲喂植株后，用GC–MS测定木质素单体含量、LC–MS/MS靶向代谢组测定可溶性木质素中间产物含量。
二、文章内容
1. RNAi 系的表型
作者首先通过RNAi的方法分别敲低了木质素合成基因：PAL2、PTAL1、C4H1、C3’H1、HCT1，并测定了RNAi系的生长情况、木质素及其单体的含量。所有RNAi系均表现出倒伏、节间缩短的表型。紫外显微镜观察和间苯三酚染色结果显示，木质素的荧光强度、染色深度都较野生型减弱（图1A）。用硫醇酸解法和乙酰溴法处理材料后，发现所有 KD 系的木质素及其单体含量整体都减少，但H木质素水平增加（图1B）。
2. 定量苯丙烷途径中间产物
为了解木质素单体合成的调节途径，作者使用靶向代谢组 LC–MS/MS 测定野生型的可溶性酚酸的含量，发现对香豆酰酯的含量最高，并且远高于其他中间产物，而含量排第二的是甲基化黄酮苜蓿素。此外，各RNAi系的木质素单体的含量由于相应基因表达的降低而减少，并且木质素合成中间产物和黄酮类化合物的积累水平也受到基因表达下调的影响（图2）。
3. PTAL1、COMT1、C3H / APX1的表达最高
为了探究哪些基因可能在木质素合成中发挥主要作用，作者鉴定了二穗短柄草中的木质素合成相关酶并分析其表达水平。基于与拟南芥同源基因的序列相似性，鉴定到23个二穗短柄草核心的木质素合成相关蛋白（表1），PTAL1的表达最高，其次是COMT1和C3H/APXs，并且这3类基因在拟南芥、水稻、玉米、柳枝稷的根和茎的维管组织中也高表达。PALs的表达仅为PTAL1的10%左右。参与游离羟基肉桂酸合成的蛋白（PTAL1、COMT1和C3H/APXs）表达水平高于莽草酸支流的蛋白表达水平（HCT、C3′H和CSE）。CCRs、木质素单体氧化酶LACs和PRXs的表达水平较低。
表1 二穗短柄草的木质素合成基因或蛋白家族
注：拟南芥同源候选基因或蛋白的表达水平。相对表达水平（高-中-低）根据微阵列数据定义。蛋白表达水平是相对BdPTAL1的百分比。
4. 木质素和黄酮类化合物途径相关蛋白的表达变化
作者检测了各RNAi系的木质素和黄酮类化合物合成途径相关蛋白的表达丰度。大部分RNAi系的被敲低的基因在蛋白水平均降低、木质素单体合成所需的P450单加氧酶（C4Hs、C3’H1、F5H6）的表达下调。所有RNAi系的LAC7和黄酮类化合物合成酶CHI表达均下调。CCoAOMT1是唯一上调的蛋白（图3）。这些结果说明RNAi系中参与木质素单体合成的酶的表达大都表现出共下调趋势。
5. 代谢物及其相关酶的变化
作者用非靶向代谢组来鉴定各RNAi系的整体代谢变化。KEGG富集结果表明，初级和次级代谢物主要跟含氮化合物、木脂素类相关。所有RNAi系的代谢物积累趋势都是苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、莽草酸、奎尼酸等木质素合成前体物质积累增加（图4）。另外，部分代谢物积累水平与相应蛋白的表达水平不一致，可能是因为其他途径对该代谢过程产生影响。
6. Phe和Tyr参与苯丙烷代谢的新途径
为探究二穗短柄草的苯丙烷途径代谢特点，作者使用同位素13C9-Phe和13C9-Tyr来饲喂野生型和RNAi系植株，并跟踪木质素及其单体和苯丙烷途径其他中间产物的同位素标记情况。结果表明：各RNAi系和3种木质素对2种同位素的利用偏好性不同（图5A–D）；Phe特异性参与C-糖基化黄酮的合成；COMT具有较高的催化效率；双子叶植物的Phe通过莽草酸支流合成G木质素和S木质素，而禾本科存在与之平行的木质素合成途径：Tyr被优先转化为芥子醇途径的代谢物，用于合成S木质素（图5E）。
7. 初级代谢与次级代谢的联系
作者推测解氨酶活性被抑制会导致初级代谢所需的NH4+水平降低。综合上述分析结果，作者总结的木质素合成与生长调节模型如下（图6）：敲低BdPTAL1和BdC4H1会下调包括解氨酶在内的多个木质素合成蛋白的表达，并且维持生长所需的蛋白大量降解，因此植株生长受限；敲低HCT1不影响解氨酶表达水平，蛋白表达水平保持相对稳定。
总结
这篇文章的实验设计很精妙，首先获得RNAi系材料，其次逐个鉴定表型、木质素组成和含量变化，然后分析蛋白和代谢物差异变化，最后跟踪标记物在合成途径的结合情况，探讨了初级代谢、次级代谢之间的联系和代谢与蛋白之间的联系，看着人家做了这么多工作，怪不得发12+分的文章呢。假如总结成条目，我想应是以下几条：
1. 科研中材料是最关键的，无论是平时搜集还是通过技术手段改造，总之科研人员手里要有丰富的材料，这样才能够好地支撑自己的科研。
2. 表型数据很重要，纵观本文，表型数据运用是比较多的，不过这也正是大部分科研人员容易忽视的工作。
3. 基因组学、蛋白质组学、代谢组学等数据挖掘很重要，靠展示分析结果就能发文章的时代已经过去，尤其想发高分文章，泛泛展示就更不可取了，直接拉低文章档次。
