引言

解析蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs）是解码生命分子机制的核心命题。长期以来，基于亲和标签的Pull-down实验及其衍生技术（如 Co-IP、AP-MS）作为经典手段，为构建静态互作网络蓝图提供了重要支撑。

然而，随着研究向动态信号转导、瞬时酶底物反应及膜蛋白复合物等复杂场景深入，传统技术的固有局限逐渐凸显。邻近标记质谱（PL-MS）技术的出现，并非对传统技术的完全替代，而是通过创新的技术逻辑，在生理条件下实现了对瞬时、微弱互作的有效捕获，为解决传统技术瓶颈提供了新的研究路径。

今天我们就对GST/His/Flag/Strep Pull-down技术的要点与局限进行全面的盘点，并进一步剖析PL-MS的解决方案，带大家一起看看这些技术如何解决科研问题。

01 亲和标签Pull-down技术的深度复盘

一、 底层逻辑与技术框架

Pull-down实验是体外检测蛋白质互作的经典方法，核心逻辑在于利用“诱饵”蛋白的高亲和力标签，从复杂细胞裂解液中特异性捕获潜在的“猎物”蛋白。与依赖抗体的 Co-IP不同，Pull-down多依赖重组融合蛋白，在验证预测互作及筛选未知结合伴侣方面具有独特灵活性。

“诱饵-捕获”系统的构建

1. 固定化：带有标签的诱饵蛋白被固定在特定的固相基质上。例如，GST标签蛋白结合于谷胱甘肽修饰的琼脂糖珠，而His标签蛋白则螯合在镍（Ni2+）或钴（Co2+）离子柱上。

2. 捕获与富集：固定后的诱饵蛋白与细胞裂解液在适宜的生理盐浓度及缓冲液条件下孵育，特异性 PPIs 发生并形成 “基质 - 标签 - 诱饵 - 猎物” 复合物。

3. 洗涤与洗脱：通过系列洗涤去除非特异性吸附的杂蛋白后，采用竞争性小分子（如还原型谷胱甘肽、咪唑）或变性条件（SDS 上样缓冲液）使复合物从基质解离，获得目标互作蛋白。

二、 主流亲和标签体系（GST/His/Flag/Strep ）的特性与选型

在Pull-down实验中，亲和标签的选择直接决定实验的信噪比与蛋白活性保持度，不同标签的生化特性差异显著，需结合实验目标、蛋白特性及成本预算进行针对性选型，下面我们就对主流标签体系进行深度盘点：

1. 谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签

● 生化原理：GST是一个约26 kDa的酶，对谷胱甘肽具有极高的亲和力。

● 核心优势：GST本身具有极佳的溶解性，能显著促进与其融合的“诱饵”蛋白的可溶性表达，保护重组蛋白免受蛋白酶降解。对于在大肠杆菌中易形成包涵体的蛋白，GST是首选标签。

● 致命弱点：GST在溶液中天然形成二聚体。这种二聚化可能迫使与其融合的诱饵蛋白发生非生理性的人为聚合，从而导致假阳性的互作信号。此外，26 kDa的较大分子量可能产生空间位阻，遮蔽诱饵蛋白的互作结构域。

● 操作细节：洗脱通常使用10-50mM的还原型谷胱甘肽，条件温和，有利于保持复合物活性。

2. 多聚组氨酸（6xHis）标签

● 生化原理： 连续的6-10个组氨酸残基通过配位键与固定化金属离子亲和层析（IMAC）基质结合。

● 核心优势： 分子量极小（约1 kDa），几乎不影响蛋白的天然结构和折叠。最重要的是，His标签与金属离子的结合耐受变性剂（如8M 尿素），这意味着即使诱饵蛋白在包涵体中，也可以在变性条件下纯化后再复性，进行Pull-down。

● 致命弱点： 特异性较差。真核细胞裂解液中含有大量富含组氨酸的内源蛋白（如代谢酶），它们极易与Ni-NTA柱发生非特异性结合，造成高背景噪音。

● 厂家建议： Thermo Fisher技术资料指出，相比镍柱，钴柱虽然结合载量稍低，但对His标签的选择性更高，能显著降低非特异性背景 。

3. Flag与Strep标签

● Flag标签： 短肽，亲水性好，免疫原性强。依赖抗Flag抗体进行捕获，特异性极高，但成本昂贵。

● Strep标签： 基于链霉亲和素与生物素的结合原理改良而来。Strep-Tactin系统提供了极高的纯度，且洗脱条件（脱硫生物素）极为温和，是目前追求高纯度复合物的首选 。

三、 核心局限性剖析：Pull down技术的“阿喀琉斯之踵”

尽管 Pull-down 技术为早期互作组学研究奠定了基础，但“体外裂解 - 捕获”的本质属性使其在复杂生物学问题研究中面临难以逾越的瓶颈，具体体现在以下三方面：

1. 裂解偏倚：细胞语境的丧失与互作真实性干扰

Pull-down 实验的首要步骤为细胞裂解，去污剂的使用会破坏精细的亚细胞结构，导致不同区室的蛋白混合于裂解液中，引发双重干扰：

▶ 假阳性风险：原本被膜结构隔离的蛋白（如核内转录因子与线粒体内代谢酶）在裂解液中因静电吸附或疏水作用发生非生理性结合，形成“裂解后互作”，成为体外实验的主要背景噪音来源。

▶ 假阴性风险：细胞内存在大分子拥挤环境，蛋白浓度极高，而裂解液通常将细胞内容物稀释数十倍，导致依赖高浓度维持的弱相互作用复合物解离，最终低于检测限。

2. 瞬时与弱相互作用的 “逃逸”：关键互作的丢失

生命活动中的核心过程（如激酶磷酸化、G蛋白偶联受体激活）多为瞬时且弱亲和力的互作，这与 Pull-down 的技术原理存在天然矛盾：

▶ 洗涤悖论：为去除非特异性背景，实验需进行高盐、高去污剂的严苛洗涤，但这一过程会将 Kd 值在微摩尔（μM）级别的弱结合伴侣一并洗脱，仅能保留核糖体亚基等稳定的结构性复合物，丢失动态功能相关的关键互作。

▶ 交联困境：虽可通过甲醛等交联剂在裂解前固定互作，但易导致复合物沉淀及非特异性交联，增加质谱数据解析难度。

3. 膜蛋白研究的技术壁垒

对于 GPCR、离子通道等多次跨膜蛋白，Pull-down 实验面临严峻挑战：此类蛋白需依赖脂质环境维持构象，而裂解过程中需使用强力去污剂（如 RIPA buffer 中的 SDS、去氧胆酸钠）才能将其从膜上溶解，这会破坏疏水性互作界面，导致关键互作蛋白丢失。

02 PL-MS 技术：针对性破解 Pull down 的技术瓶颈

为突破 Pull-down 的物理限制，PL-MS 实现了技术范式的根本转变 —— 从 “先裂解，后捕获”转为“先标记，后裂解”。

一、 核心理念

通过基因工程将生物素连接酶或过氧化物酶融合于诱饵蛋白，在活细胞生理条件下，添加特定底物后，酶会在诱饵蛋白周围（约10-20 nm半径内）产生高活性生物素中间体，与邻近蛋白的氨基酸残基发生共价反应，实现“原位标记”。

这种标记方式将空间邻近关系转化为稳定的共价键，后续无论采用何种剧烈裂解条件，标记信息均不会丢失，再通过链霉亲和素与生物素的高亲和力富集目标蛋白。

二、 破解Pull-down的核心局限

▶ 解决裂解偏倚：标记在活细胞内原位进行，保留细胞天然空间语境，避免 “裂解后非生理性互作” 与 “弱互作稀释解离”。

▶ 捕获瞬时弱互作：无需在纯化过程中维持互作，只要标记时间窗口内猎物蛋白靠近诱饵蛋白即可被标记，成功捕获激酶底物、信号转导复合物等动态互作。

▶ 适配膜蛋白研究：无需依赖强力去污剂维持复合物稳定性，标记后可通过变性条件裂解，不破坏互作信息，适配膜蛋白等难溶性蛋白的互作研究。

三、 关键工具与应用场景

PL-MS 的核心工具可分为生物素连接酶家族（BioID、TurboID）与过氧化物酶家族（APEX2），其特性适配不同研究需求，简要如下：

▶ BioID：第一代生物素连接酶，标记需 18-24 小时，适合稳态复合物普查，局限性为动力学慢，无法捕捉动态事件。

▶ TurboID：经定向进化获得，活性较 BioID 提升 15 倍以上，10 分钟即可完成有效标记，适用于动态过程、活体动物 / 植物等场景，变体 miniTurbo 更小，背景更低。

▶ APEX2：工程化过氧化物酶，标记仅需 1 分钟，时间与空间分辨率极高，适合秒级信号转导、亚细胞结构研究，局限性为需使用 H2O2，对细胞有氧化毒性。

03 结语

解析蛋白质 - 蛋白质相互作用的技术选择，核心是科研需求与技术特性的精准适配。亲和标签Pull-down 技术凭借成熟流程、灵活标签体系及可控成本，仍是验证稳定互作、筛选候选结合伴侣的经典方案，尤其适用于可溶性蛋白结构性复合物的研究。

而PL-MS通过“原位标记、后裂解捕获”的范式革新，精准破解了 Pull-down 的裂解偏倚、瞬时弱互作逃逸及膜蛋白研究难题，其不同工具（BioID/TurboID/APEX2）适配稳态普查、动态追踪等多样场景，为复杂互作解析提供了全新支撑。

两种技术并非替代而是互补：Pull-down 奠定基础，PL-MS 拓展边界。科研中需结合互作类型（稳定 / 动态）、蛋白特性（可溶性 / 膜蛋白）及技术需求，合理选用或组合，方能更真实、全面地解码生命分子网络，为生命科学研究赋能。

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