一.引物设计的原则：

(1)引物长度一般在15~30 bp之间。

引物长度常用的是18-27 bp ，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。

(2)引物GC含量在40%~60％之间

GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50％寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般低于Tm值5~10℃。

(3)碱基要随机分布

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的 G或C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。

(4)引物自身及引物之间不应存在互补序列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

(5)引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰

引物的5'端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

二.设计引物的四种方法

①查询相关SCI文献(IF=5.0以上)

②引物数据库(Primerbank和公司数据库，但物种只限于人和小鼠)

③NCBI在线设计和验证(Primer-BLAST)

④软件设计引物(如SnapGene)

三.SnapGene设计引物

基因图谱如图

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1.选中需要设置引物的基因,在左下角选择"Sequence"查看其基因序列

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2.从前往后拉直到Tm约为60度左右，以GC结尾

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3.再往前拉15bp的同源臂加到引物上

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4."Ctrl+R"可进入设置引物界面，选择设置的是前引物还是后引物

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5.把前面选择的两段序列copy至此即为引物序列，并查看其GC含量是否在40%-60%，然后保存序列

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6.设置后引物时拉到最后，仍是选择GC结尾、Tm为60°左右，复制该序列

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7.点击"New"

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8.出现如下界面，将序列粘贴至此，点击"Reverse complement",将新出现的序列粘贴出来(不用保存)

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9.到开头去拉15bp的同源臂，重复前引物的保存步骤，设置完引物后记得保存图谱及序列

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