Nature cancer | 免疫检查点阻断与新抗原疫苗联合治疗可有效控制肿瘤

原创 骄阳似我 图灵基因 2022-04-18 09:04

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：新子刊

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亮点： 

诱导肿瘤特异性T细胞反应的新抗原疫苗在早期临床试验中取得了良好的抗肿瘤效果。本文观察到新抗原疫苗生成的T细胞可以与免疫检查点阻断协同有效地控制肿瘤。本文的研究概述了在新抗原疫苗和免疫检查点阻断治疗期间肿瘤浸润性T细胞的动力学，并高维度地识别了新抗原反应性T细胞特征，以用于未来抗肿瘤治疗策略的开发。

T细胞在癌症免疫治疗中起着不可或缺的作用。抗肿瘤T细胞免疫的治疗策略，如免疫检查点阻断（ICB）、新抗原疫苗和过继性T细胞转移，已在患者中看到希望。然而，许多患者在临床上对这些治疗有抵抗力，抵抗的潜在机制尚不清楚。在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中，抗原特异性T细胞是唯一能够通过其独特的T细胞受体（TCR）特异性识别癌细胞、启动细胞毒性途径以杀死靶细胞并建立T细胞记忆的群体。由肿瘤特异性体细胞改变引起的新抗原是更有希望的治疗靶点。然而，这种疫苗诱导的新抗原特异性T细胞免疫应答在患者之间仍然存在差异。此外，辅助性抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）治疗可以克服对这种治疗的耐药性，这表明一些患者可能需要联合治疗。

尽管临床上取得了成功，关于新抗原疫苗的许多免疫学问题尚不清楚。首先，哪些T细胞亚群在应答者中起重要作用，它们的代表性生物标志物是什么？第二，疫苗治疗后体内新抗原特异性T细胞活化或衰竭的机制是什么？最后，新抗原疫苗如何与ICB协同克服临床耐药性？引流淋巴结（DLN）和肿瘤组织都参与了抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）介导的T细胞免疫反应。因此，重新激活先前存在的T细胞或淋巴组织中的克隆替代物可能有助于联合治疗的疗效。要解决这些问题，需要对新抗原疫苗治疗期间的T细胞动力学进行仔细研究，并彻底调查ICB治疗的佐剂使用如何特异性地重塑肿瘤微环境（TME）。

近期，在nature cancer杂志上发表了一篇名为“Concurrent delivery of immune checkpoint blockade modulates T cell dynamics to enhance neoantigen vaccine-generated antitumor immunity”的文章，利用MC38模型来研究新抗原疫苗接种、抗PD-L1治疗和联合治疗期间的T细胞动力学，首次在人类身上复制了这一观察结果，表明联合治疗比单独接种疫苗能产生更好的抗肿瘤效果。

为了研究新抗原疫苗诱导的T细胞反应和体内抗肿瘤效应，首先对小鼠结直肠肿瘤模型MC38进行了新抗原疫苗治疗。选择9-聚体突变ADP依赖性葡萄糖激酶（ADPGK）肽（ASMTNMELM）作为新抗原，两种Toll样受体（TLR）激动剂作为佐剂进行试验。两剂新抗原ADPGK疫苗显示出中度抗肿瘤效果，肿瘤生长延迟。然而，没有观察到肿瘤消退，这表明单独使用新抗原疫苗的抗肿瘤效果有限。假设免疫抑制TME通过操纵T细胞功能状态来限制新抗原疫苗的效力。为了验证这一假设，分析了来自PD-L1表达MC38模型的TIL的scRNA序列数据。骨髓细胞群，尤其是肿瘤中的中性粒细胞和常规DC，与淋巴结中的对应细胞相比，PD-L1表达水平更高。单独使用抗PD-L1或新抗原疫苗治疗MC38荷瘤小鼠显示出部分反应，而联合治疗则导致肿瘤完全消退，并显著改善存活率。图1：新抗原疫苗与ICB协同作用，诱导持久的抗肿瘤免疫反应。

幼稚细胞（CD8-01-Sell-P.na和CD4-01-Tcf7-P.na）、记忆细胞（TM）（CD8-02-Gzmm-P.em和CD8-03-Gpr183-P.cm）、Treg细胞（CD4-02-Foxp3-P.Treg）和滤泡辅助性T（TFH）细胞（CD4-03-Cxcr5-P.TFH）在淋巴组织中富集，而其他CD4和CD8簇优先富集于肿瘤浸润性T细胞。为了研究肿瘤进展过程中T细胞状态的动态变化，比较了早期（第10天）和晚期（第20天）的T细胞间隔。早期只有少数（4.3%）CD8 TIL具有衰竭表型（CD8-08），含有较少的Treg细胞（CD4-05）。因此，TME在早期由新浸润的T细胞组成，在晚期具有更强的免疫抑制作用。在研究TIL对不同免疫疗法的反应时，观察到新抗原疫苗单一疗法降低了功能失调的CD8 T细胞的百分比，同时增加了CD8 Teff细胞（CD8-05）。然而，在治疗期间，Treg细胞的比例也增加了。与单独使用疫苗相比，与ICB联合使用可显著增加Teff细胞（70%），并减少功能失调的CD8 T细胞和Treg细胞。同时，TH1样细胞（CD4-06）是肿瘤组织中占主导地位的CD4细胞群。联合化疗治疗肿瘤含有较低水平的具有衰竭表型的Treg细胞和CD8 T细胞。与多个抑制性受体的持续高表达相比，关键转录因子（例如NR4A、TOX、BATF）的表达可以更好地区分衰竭T细胞和Teff细胞。事实上，联合治疗也显著降低了TOX+CD8 T细胞的百分比。同时，联合治疗组的CD4-TH1细胞增加，如核因子κB配体受体激活剂（RANKL），RANKL是CD4-06表达的代表性标记物。基于这些结果得出结论，联合治疗产生的TME可能有利于Teff细胞功能。图2：TIL对不同免疫疗法的反应动力学。

在65058个具有全长TCR的T细胞中鉴定出12053个克隆性T细胞，使能够跟踪T细胞克隆的扩展、状态转换和迁移。“克隆性”被定义为一个以上携带相同TCR对的T细胞。大多数克隆性T细胞分布在富含肿瘤的簇中，随着不同治疗的反应而发生显著变化。使用克隆评分（CS）来量化克隆扩展的程度（方法）。对克隆性T细胞的分析表明，联合治疗不仅促进了Teff细胞的浸润，而且阻止了Teff细胞的终末分化，从而重塑了TME。图3：克隆性T细胞亚群的谱系追踪与免疫治疗相关。

由于免疫原性表位的鉴定有限，肿瘤特异性T细胞的特征尚不明确。为了克服这一障碍，用新抗原ADPGK接种小鼠，获得流动分选的新抗原-MHC-I四聚体+T细胞的TCR序列。由于四聚体染色和流动分选过程可以捕获一定比例的非抗原特异性T细胞，进一步应用iSMART算法，根据TCR的相似性对其进行聚类，以提高新抗原特异性TCR识别的准确性。聚类后，四聚体文库中共鉴定出1415个TCR组。然后将各组中的T细胞数量与未治疗小鼠淋巴组织中的T细胞数量进行比较，发现20个TCR组显著富集。在这两个质量保证步骤之后，将这些TCR定义为高置信度新抗原ADPGK特异性TCR。使用这些TCR追踪scRNA序列数据中的新抗原特异性T细胞，发现它们在联合治疗组中富集。这些结果表明，ADPGK特异性T细胞在早期阶段渗入TME，但在后期很少在耗尽的簇中检测到。这一簇中的T细胞也可能主要识别其他肿瘤特异性抗原，但不识别ADPGK，因为慢性TCR刺激通常被认为是T细胞衰竭的主要驱动因素。联合治疗后，ADPGK特异性T细胞富集，并具有Teff细胞表型。因此，联合治疗可能会促进ADPGK特异性T细胞的募集，但不会促进原有细胞的状态转换。ICB治疗配合新抗原疫苗接种，促进肿瘤中产生IFN-γ的新抗原特异性T细胞。为了进一步描述体内新抗原特异性T细胞的特征，对scRNA-seq分析确定的表面标记进行了染色。与单独治疗相比，联合治疗显著降低了LAG3+CD8 T细胞的百分比，并增加了TIL上CXCR3的表达。图4：识别新抗原特异性T细胞对联合治疗的反应。

克隆性T细胞的谱系追踪显示，新抗原特异性T细胞与DLN中的TCM细胞（CD8-03）和肿瘤中的耗尽性T细胞（CD8-08）具有较高的T淋巴细胞数。接下来探究联合治疗诱导的Teff细胞是来自肿瘤中原有的T细胞，还是来自淋巴组织中新浸润的T细胞。在联合治疗前和治疗期间使用S1P受体激动剂FTY720来阻断T细胞从淋巴结流出。FTY720完全消除了抗肿瘤作用，表明DLN新浸润的T细胞至关重要。同时，FTY720治疗显著降低了产生IFN-γ的CD8 T细胞和四聚体+T细胞的百分比，这进一步表明淋巴组织是肿瘤中新抗原特异性T细胞的主要来源。为了研究新抗原疫苗引发的DLN中的T细胞是否足以在存在抗PD-L1的情况下介导持久的抗肿瘤免疫反应，用新抗原疫苗接种天真小鼠，并在6天后收集DLN中的淋巴细胞。然后将细胞过继转移到带有Rag1的MC38−/− 随后进行抗PD-L1治疗的小鼠。新抗原疫苗诱导的淋巴细胞而非DLN中的幼稚淋巴细胞与抗PD-L1协同控制肿瘤。此外，抗PD-L1治疗显著增加了过继后脾脏和肿瘤中抗原特异性T细胞的百分比。联合治疗后，另一个MC38表位（小鼠白血病病毒（MuLV）p15E）特异性T细胞的百分比也显著增加。这一结果与最近的一项研究一致，该研究表明，在最初的肿瘤抗原引发后，T细胞反应可能会经历表位扩散。基于这些结果得出结论，抗PD-L1通过使来自DLN的新抗原特异性T细胞再生，扩大了新抗原疫苗的治疗效果。图5：新抗原疫苗和ICB协同介导抗肿瘤免疫反应，依赖于来自DLN的T细胞。

为了探索MC38的新抗原特异性T细胞基因特征在人类癌症中是否可复制，首先定义了新抗原特异性T细胞的基因特征。为CD8-05选择了在人类基因组中也发现的DEG，并通过使用每个DEG作为针对所有其他CD8 T细胞的CD8-05预测因子来执行监督特征选择。前五名最具辨别力的制造者的平均表达达到了0.92的曲线下高区域（AUC）。因此将这五种标记物的平均表达定义为癌症抗原特异性T细胞（CAST）评分，它可以作为新抗原特异性T细胞分数的替代物。在癌症基因组图谱（TCGA）数据库中评估了人类癌症的CAST评分，并选择了23种癌症类型和100多名患者来研究其在预后中的作用。由于CD8 T细胞浸润是多个TCGA癌症患者预后的预测因子，进行按CD8 T细胞水平分层的Cox比例风险回归，并在单变量Cox模型中估计了CAST评分的风险比（HR）。CAST评分显著预测了黑色素瘤、头颈部、宫颈癌和胰腺癌患者CD8 T细胞浸润高但不低的总体生存率。因此，小鼠新抗原特异性T细胞的鉴别标记物可以预测CD8 T细胞高浸润的患者存活率。由于大多数TCGA样本未经免疫治疗，接下来使用ICB治疗下的人类样本研究CAST评分的表现。克隆扩增是抗原特异性T细胞应答的证据。最近的一项研究报道，“大”CD8+克隆（频率>0.5%）可以预测ICB治疗的疗效，并与转移性黑素瘤患者的效应记忆T（TEM）细胞百分比相关。Teff细胞（CD8-05）上调了几种细胞毒性标记物，它们也是这些大克隆的标志基因。为了测试CAST评分是否能预测人类肿瘤中的大CD8+克隆，分析了抗PD-1治疗前后晚期基底细胞癌（BCC）患者的公共数据集。事实上，CAST评分与CD8+T细胞克隆频率显著相关。此外，具有高CAST分数的大型克隆在表型上相似。最后，抗PD-1治疗增加了四分之三患者的CAST评分，从而证实了ICB在TME中扩张抗原特异性T细胞的作用。图6：抗原特异性T细胞的鉴别标记物与人类肿瘤中更好的存活率相关。

本文对ICB联合新抗原疫苗治疗进行了机理研究。通过对约10万个T细胞进行scRNA序列分析，研究了不同时间点和联合治疗下TIL的分布情况。个体化疫苗与ICB联合应用在黑色素瘤患者中的疗效已得到证实。然而，这种联合治疗促进T细胞活化的潜在机制尚未明确。本文的工作补充了目前对新抗原疫苗的人类临床研究，并解决了有关其抗肿瘤免疫反应的一些基本问题。但目前研究仍有一定的局限性。首先，可能需要来自其他合格小鼠模型的额外scRNA-seq数据来确认和改进抗原特异性T细胞的特征基因的定义。其次，尽管新抗原ADPGK的使用足以绘制肿瘤特异性CD8 T细胞簇，但针对其他肿瘤特异性表位的T细胞尚不明确。第三，研究侧重于分析T细胞群体，但排除了其他免疫细胞类型。尽管如此，研究结果表明，某些髓样细胞群也可能在联合治疗中发挥重要作用。最后，需要使用人类癌症活检的额外scRNA-seq数据来验证结论。预计在这项工作中确定的细胞亚群和生物标记物将为有效的新抗原疫苗疗法的未来发展提供信息，并为癌症免疫疗法的预后提供临床益处。

教授介绍：

付阳新教授一直在通过蛋白质工程开发新型免疫治疗分子、抗体和武装抗体。已经建立了表达各种致癌受体的小鼠肿瘤模型来模拟临床肿瘤。付阳新的实验室在了解传统癌症疗法如何依赖和影响免疫系统方面取得了重大进展。他坚信，如果免疫疗法要在临床上取得成功，就必须在当前的护理标准治疗期间彻底了解免疫。当前的标准癌症疗法通常无法清除晚期癌症。最近的研究集中在结合常规药物或添加其他治疗方法，如照射和致癌受体阻断剂。不幸的是，即使采用这些策略，复发也经常发生。

在过去的 10 年中，付阳新领导了对强化标准治疗（如放疗和化疗或更多新型免疫疗法）后肿瘤复发和治疗抵抗（两个相关的临床问题）的潜在机制的调查。他了解到，虽然肿瘤选择可能是内在的，但肿瘤逃避也可能从治疗后产生的微环境的外在变化演变。付阳新一直专注于了解常规抗癌治疗后肿瘤微环境中这些定义不明确的变化。事实上，尽管通过常规疗法初步控制了肿瘤生长，但由于随着时间的推移会发生各种免疫抑制途径，包括缺乏足够的树突状细胞 (DC)/T 细胞浸润、新出现的与治疗相关的耐药性，复发仍然经常发生。或在成熟的肿瘤组织中增加 M2 肿瘤相关巨噬细胞的数量。

由于许多常规药物和治疗方法会抑制免疫反应，因此目前的免疫疗法难以整合到标准护理中。在最近的抗CTLA4 和抗 PD-1/PDL-1 试验之前，免疫疗法一直被视为最后的治疗选择。如果不了解当前治疗对免疫的影响，潜在有效的免疫治疗可能无法显示出有希望的效果。然而，从付阳新对肿瘤进化逃避机制的研究工作中，现在可以设计新的策略，将强化的常规疗法与免疫疗法更好地结合起来，从而更有效地杀死肿瘤细胞，同时最佳地调动宿主免疫以实现完全的肿瘤。消退和预防转移。

参考文献：

Liu, L., et al., Concurrentdelivery of immune checkpoint blockade modulates T cell dynamics to enhanceneoantigen vaccine-generated antitumor immunity. Nat Cancer, 2022.