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//文献
2021年发表于Cancer Discovery，影响因子39.397，典型的几乎纯分析的单细胞转录组文章。
Resolving the spatial and cellular architecture of lung adenocarcinoma by multi-region single-cell sequencing
//摘要
文章对来自5 个早期 LUAD 和 14 个多区域距离肿瘤很近的正常肺组织的186,916 个细胞进行单细胞 RNA 测序。展示了从正常区域向LUAD转变的细胞谱系、状态和转录特征。LUAD表现出明显的肿瘤内单个位点的细胞异质性和转录谱系可塑性。T regulatory cell在与LUAD 接近的正常组织中的细胞中增加，细胞毒性 CD8+ T 细胞、抗原呈递巨噬细胞、炎性树突状细胞减少。进一步发现 LUAD 配体-受体相互作用中具有介导促肿瘤表型的上皮CD24表达增加。这些数据提供了 LUAD 演化的空间图谱，以及用于识别治疗目标的数据资源。
//实验设计
文章在单细胞分辨率上辨别周围肺和早期 LUAD 的空间图谱，以更好地理解 LUAD 演化的结构。我们对 19 个空间区域进行了深度 scRNA-seq 分析，包括富集的上皮细胞群，来自 5 个早期 LUAD 和 14 个多区域距离肿瘤很近的正常肺组织。 文章致力于揭开LUAD肿瘤进化轨迹，细胞群的空间进化，以及描述早期 LUAD 的表达特征。
5例早期LUAD，P2-P5分别取肿瘤、癌旁、中间、远端组织，P1无中间样本。
//分析思路
思路总结：
1.基因集评分在单细胞中的广泛应用，很多文章都有自定义的基因集。
2.本篇文章巧妙的实验设计，为早期LUAD多区域图谱增加了很多内容。
3.如何从分析结果中找到有意思的分析点？并通过多种方法论证推断。
//主要结果
- 问题：早期LUAD的单细胞图谱是怎样的？
P1样本单独进行scRNA分析，共得到15132个细胞，EPCAM+上皮细胞在三个不同位置的平均比例为4.2%。为了更好的描绘上皮细胞谱系，对P2-5样本进行流式分选，分为EPCAM+和EPCAM-，以富集上皮细胞，共得到186916个细胞，中值基因1844，上皮细胞比例37.6%。
相比于正常组织，增殖上皮细胞主要在LUAD中富集，而且EPCAM+细胞基因表达数目高于EPCAM-。层次聚类结果表明LUAD中细胞类型和正常组织转录差异明显。对空间细胞组成的分析显示，肿瘤邻近程度越高，其拓扑梯度越明显，这在所有患者中都是一致的，特别是在LUAD中，B细胞的比例增加，NK细胞的比例下降。
这些结果表明了早期LUAD在肿瘤微环境(TME)中的空间转录组异质性。
- 问题：肺上皮细胞的空间差异和LUAD的肿瘤内异质性如何？
上皮细胞进一步细分为10个细胞类型。C9主要来自LUAD样本，且CNVscore非常高。相对于来自肿瘤中间或远处正常位点的细胞，来自癌旁正常组织的细胞在转录规律上与LUAD的细胞更相似。
肺泡分化层次已被证明参与肺肿瘤的体内发展。在我们的队列中，具有明确谱系特征的肺泡细胞(如AT1、AT2和肺泡祖细胞)在LUAD组织中消耗殆尽。通过拟时序分析发现了AT2向AT1分化的轨迹，而且NOTCH信号也在分化轨迹中逐渐增高。
C9进一步细分，发现P2中的LUAD CNV score较低，因此对KRAS进行突变检测(5` scRNA，可以检测到)，P2中29%的C9细胞携带KRAS G12D突变，和KRAS野生型细胞相比，高表达MUC5AC和LCN2等基因。这些发现强调了KRAS驱动突变和细胞谱系的空间异质性模式，这可能是KRAS突变LUAD生态特有的。
和P2不同，P3中C9存在大规模的染色体变异，主要分为4个cluster，C2-4变异较为明显，且C4存在一处特异的CNV事件，可能处于P3 LUAD演化轨迹的后期，轨迹分析也证明了这一点。P5中C9分为7个不同的cluster，拟时序分析显示C4到C1的分化轨迹。
- 问题：淋巴细胞重编程如何促进肿瘤微环境？
淋巴细胞进一步细分，共发现10个细胞类型，相对于正常组织，LUAD富含plasma(SDC1+/MZB1+)、B (CD19+/CD22+)和T regulatory(Treg;FOXP3 +)细胞。随着肿瘤邻近程度的增加，我们注意到NK(GNLY+)和 innate lymphoid cells(ILCs)， GZMA-hi和GNLY-hi的CD4+ cytotoxic T(CTL;CD40LG +,BATF+)和GNLY-hi CD8+ CTL逐渐降低，在LUAD中都被耗尽。
通过基因集评分，Naive CD8表现出高初始、低毒性特点。GNLY-hi CD8+ CTL高表达细胞毒性基因，但是在LUAD样本中耗尽。CD8+ CTL显示空间调节显著降低细胞毒性标记评分，并降低主要细胞毒性基因如NKG7和GNLY的表达，LUAD中这些基因表达都是最低的。
LUAD组织特异性富集FOXP3+ Tregs，Treg score随着LUAD的距离而显著增加。Tregs细胞也表达高水平的肿瘤免疫检查点。共表达CTLA-4和TIGIT免疫检查点的Tregs的比例沿着远端正常位点到更接近肿瘤区域逐渐升高，Treg score随着LUAD的临近而显著增加。
分析plasma和B细胞发现，吸烟者(P2和P3)的plasma比例明显高于非吸烟者，TCGA的数据也证明了这一点。我们还鉴定了3种不同的B细胞亚群，包括一个LUAD富集的亚群(C0)，其高表达RAC2+和ACTG+，已知在B细胞突触形成中起关键作用。与匹配的正常肺组织相比，B细胞signature(C0)在非典型腺瘤性增生(AAH)、LUAD的肿瘤前前体和侵袭性LUAD中逐渐增加，B细胞signature也与延长的总生存期(OS)和无进展间期(PFI)相关。
- 问题：LUAD早期抗原提呈髓细胞的特点？
髓系细胞进一步细分，发现随着肿瘤邻近程度的增加，M2-like macrophages C5、monocytes经典和非经典)和mast逐渐减少，而M2-like macrophages C1、 proliferating myeloid和cDC2细胞在肿瘤中稳步富集。此外，我们发现，与主要富集在正常样本中的C5 M2-like macrophages相比，C1 M2-like macrophages的抗原呈递评分显著降低，随着LUAD的空间邻近性增加，抗原提呈标记基因的表达水平显著降低。
三个cDC2亚群中，C1炎症基因score最低，并在LUAD中大量富集。炎症信号(高度富集于C2)和MHC II类基因(富集于C0/C1)的差异表达，此前已被证明可以区分炎症性和非炎症性cDCs。炎症评分最高的cDC2亚群(C2)进一步以空间上的炎症标志物评分为特征，随着肿瘤邻近程度的增加而显著减弱。非炎症性与炎症性的得分在cDC2中相对较高在TCGA LUAD队列中与OS和PFI延长相关。
- 早期LUAD的受配体互作特性
利用iTALK内置数据库针对 checkpoint-receptor、cytokine-receptor进行计算分析和标注。计算Jaccard index，发现与更近端(相邻，中间)区域相比，肿瘤与远处正常组织之间的L-R相互作用重叠减少。我们发现，与它们各自的空间正常组织相比，LUADs中改变的细胞相互作用受到显著和差异的调节。在细胞因子受体对中，LUADs显示CX3CL1+肿瘤上皮细胞与表达其同源受体CX3CR1的DCs或巨噬细胞之间的交流增加。
值得注意的是，我们发现肿瘤上皮细胞上的免疫检查点蛋白CD24或LGALS9 和巨噬细胞上的SIGLEC10或DC上HAVCR2之间的相互作用增强，并且在多个患者中共享。这些相互作用在与LUAD距离不同的肿瘤组织与正常组织中差异富集。CD24和LGALS9在LUAD组织的上皮细胞中表达水平总体上增加，特别是在恶性肿瘤富集的细胞簇中。这些发现表明，早期LUAD生态中存在细胞互作，使促肿瘤炎症和免疫抑制状态增加。
上述发现促使我们使用外部队列来验证CD24表达模式。我们发现该抗原在正常肺组织、AAHs和LUADs中的表达逐渐显著增加。CD24与上皮marker EPCAM的表达以及促肿瘤和免疫抑制基因(TIGIT, CTLA4, FOXP3, CCL19)的水平呈正相关，而与抗肿瘤免疫标记物(GZMB, GZMH, PRF1)负相关。使用早期LUAD内部队列，我们发现相对较高的CD24与缩短的OS和PFI相关。我们进一步发现，在同基因小鼠模型中，通过CRISPR介导敲除Cd24a或使用中和抗体抑制Cd24a，显著降低了小鼠LUAD细胞在体内的生长。这些发现表明，在早期LUAD中，CD24是一个富集的细胞互作的核心，它与促肿瘤免疫环境和不良预后相关，并促进LUAD在体内的生长，相对较高的CD24与缩短的OS和PFI相关
