RNA酶是导致RNA降解的主要物质,广泛存在且稳定,可耐受多种处理(如煮沸、高压灭菌等)而不被灭活。RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子,因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,进而直接影响RNA分析结果。在所有RNA实验中,核糖核酸酶(RNA酶)的污染是导致实验失败的主要原因。因此,在RNA的制备与分析操作实验中,要严格防止RNA酶的污染。在RNA提取实验前对器材及试剂的处理非常的关键。焦碳酸二乙酯(DEPC)是一种强烈的RNA酶抑制剂,其通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使RNA酶变性,从而抑制RNA酶的活性。
(1)溶液处理 RNA制备过程中使用的所有溶液(包括水及其它盐溶液),需用0.1% DEPC,在37℃处理12 h以上;然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22 μm滤膜过滤除菌。处理后的溶液要单独存放。
(2)塑料器皿的处理 所有的塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。离心管和枪头等塑料器皿经0.1% DEPC,在37℃处理12 h以上,高压灭菌(尽量使用一次性无菌塑料制品;已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理)。
(3)玻璃器皿的处理 所有的玻璃器皿均应在使用前于200℃以上高温下烘烤至少6 h。
(4)有机玻璃的电泳槽等处理 先用去污剂洗涤、双蒸水冲洗、乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2中,室温下泡10 min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
确保RNA实验中使用的试剂及器材都经过RNA酶灭活处理,后续的RNA提取才能做好。