板块“与实验结缘”代号“Destiny”（命运）主要想与大家聊聊，科研中“干”“湿”实验结合的那些事儿。

肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗等肿瘤学研究的一个重要指标。Transwell实验是研究细胞迁移和侵袭能力最常用的实验手段。

以之前解析的肺腺癌（LUAD）文章[1]为例（具体解析见Masterpiece｜空间+单细胞，文章轻松上10分），文章使用单细胞测序数据分析得知基因UBE2C影响LUAD侵袭过程。之后使用Transwell实验研究基因UBE2C对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。

RNAi可以使肺癌细胞的UBE2C基因保持在静默或休眠状态，从而构建UBE2C低表达肺癌细胞。通过Transwell实验检测比较正常肺癌细胞与UBE2C低表达肺癌细胞迁移、侵袭能力。实验结果（图1）显示基因UBE2C沉默后，肺癌细胞迁移、侵袭能力变差。从而直接验证单细胞测序数据的结论：基因UBE2C影响LUAD侵袭过程。

图1 细胞功能验证实验结果图（NC为基因UBE2C正常表达的肺癌细胞）

下面来聊一聊Transwell实验常见问题及解决方法。

01  细胞迁移和侵袭的差别

细胞迁移指的是细胞因为受到刺激（化学信号影响）从原本的位置移动到另一个位置的运动。损伤修复、细胞分化、胚胎发育以及恶性肿瘤转移等诸多生理/病理过程都需要通过细胞迁移来完成。

细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是"侵袭"需要细胞穿过胞外基质层(ECM）或基底膜基质层(BME)，在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度驱使下完成从一处到另一处的移动（图2）[2]。细胞侵袭通常发生在正常细胞的炎症反应过程中，也常发生在恶性肿瘤细胞的转移过程中。

图2 肿瘤细胞转移过程

02  Transwell基本实验流程

Transwell小室可以架在细胞培养板的孔上，底部不接触细胞培养板（图3）。待研究的细胞接种在Transwell小室的微孔膜上，在小室和下室分别加入含有不同浓度的趋化因子的培养基（下室浓度>小室浓度）。细胞在实验时，为了获得更多的营养，会挤压自身以穿过微孔膜上的小孔然后粘附在小室底膜的下表面。实验结束后，用棉签擦掉小室膜上表面的细胞，将小室放入染色液染色，使下表面的细胞着色，就可以在显微镜下拍照统计细胞数量来评价迁移/侵袭实验。

与迁移实验不同的是，侵袭实验需要在小室微孔膜上额外包被一层基质膜，包含胶原、纤粘蛋白、层粘连蛋白等（注意：有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验）。

图3 细胞迁移、侵袭实验示意图[3]

03  如何选择Transwell小室产品

一般来说，共培养实验、Caco-2 Transport实验及构建细胞极化模型等不需要细胞穿膜，大多选择0.4μm或1.0μm等小孔径的产品。

而在细胞迁移实验及侵袭实验中，细胞则需要穿过小室的膜，到达膜的背侧，因此需要选择较大孔径，如肿瘤细胞的迁移、侵袭实验常选择8μm孔径的产品。

04  实验常见问题及解决方案

A、如何判断细胞是否有侵袭能力？

实验前先用酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，特别是MMP-2的表达。有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

B、小室放入细胞培养板时，出现气泡，是否会影响实验？

一旦产生气泡，下室培养液的趋化作用就减弱甚至消失了。所以将小室放入培养板时要注意，如有气泡产生，须将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

C、侵袭时间要多久？

侵袭时间一般为24-48h，可以参考迁移实验，不建议超过这个时间，会被质疑是否为细胞增殖。具体时间需要根据细胞的转移能力来进行判断。

D、铺细胞前，有液体穿过小室会对实验产生影响吗？

基底膜水化后，需要检查是否有液体穿过小室进入到下室中，需要保证无液体穿过才可以继续接种细胞。

E、接种细胞是不是越多越好？

不同的细胞，其侵袭能力是不同的。接种细胞量过多时，穿过膜的细胞会过多，最后导致计数困难；而接种细胞过少时，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过微孔膜进入下室。因此最少也要保证在收样的时候，小室内还要有一定量的细胞存在。

引用文献

[1] Zhu, Jianfei et al. “Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics.”Experimental & molecular medicine vol. 54,11 (2022): 2060-2076. doi:10.1038/s12276-022-00896-9

[2] Valastyan, Scott, and Robert A Weinberg. “Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.”Cell vol. 147,2 (2011): 275-92. doi:10.1016/j.cell.2011.09.02

[3] van de Merbel, Arjanneke F et al. “Protocols for Migration and Invasion Studies in Prostate Cancer.”Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) vol. 1786 (2018): 67-79. doi:10.1007/978-1-4939-7845-8_4

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