文章名：Well-Paired-Seq: A Size-Exclusion and Locally Quasi-Static Hydrodynamic Microwell Chip for Single-Cell RNA-Seq
发表时间：2022-5-6
通讯作者：杨朝勇（厦门大学）
杂志：Small Methods
影响因子：15.367/Q1（2022）

Well-Paired-Seq技术相关介绍

  Well-paired-seq 芯片（图1a）由上万个双层微孔组成（图1 b、c），上下两层分别被设计为单个微球和细胞的捕获孔，微球捕获孔设计为内切圆直径和高度均为 50µm 的六棱柱型，细胞捕获孔长宽高均为 25µm。

图1 芯片结构

  Well-Paired-Seq基于双孔嵌套式芯片，协同局部准静态流体力学和尺寸排阻原理，实现细胞和编码微球高效精准“配对”，利用准静态流体力学特性有效清洗背景，具有高效的细胞捕获率、细胞/微球配对效率以及游离RNA去除等优势，实现高通量细胞捕获、高灵敏基因检出和单细胞高保真分子解析。

  通过软件模拟流体行为（图2d），在 0.45 m/s 的速率下，其下方的细胞捕获孔实现了流体速率最大程度的下降，可视为准静态（图2e）。因此，当在流动通道中引入较大的流体扰动时，最下层的细胞捕获孔扰动极小，从而实现在不影响已捕获细胞的情况下，去除微球捕获孔中多余细胞。还可以进行多次沉降捕获，产生累积捕获效应，提高细胞与微球配对效率。

图2 芯片流体学（软件模拟）

  Well-Paired-Seq操作流程如下：1、首先依次捕获细胞和微球，使其1:1配对；2、然后通入含表面活性剂颗粒的矿物油封闭上层微孔，表面活性剂沉降并溶于微孔中的缓冲液，从而裂解细胞；3、释放的 mRNA 被微球捕获，回收微球后进行逆转录、cDNA 扩增及后续的建库测序，通过识别细胞和分子编码得到高至 100, 000 个单细胞的基因表达谱。
  值得注意的是，该技术增加了矿物油封闭裂解的新方法，为细胞裂解创造封闭环境，避免孔间 mRNA 交叉污染。

图3 工作流程

芯片性能测试数据

1、高效的细胞捕获

  在芯片中加载细胞和微球，微孔的占有率分别能达到 83%（细胞）和 99%（微球），配对率约为 82%（图4 a、b），相较于其他基于微孔的平台，本平台的配对率增加了 8 倍。此外，在不同细胞投入量下，通过三次累积捕获均可达到 90% 左右的细胞捕获率（图4 c，显微镜下观察计数）。

2、密封微孔避免交叉污染

  在芯片中通入荧光染料并用矿物油覆盖（图4 d），与双孔处荧光强度形成鲜明对比，孔间位置的荧光无检出（图4 e），表明矿物油有效的密封了微孔。将 Calcein AM 染色的细胞加入微孔，可以观察到细胞裂解物的荧光被限制在双孔中，表明通过矿物油密封可高效地裂解细胞并避免交叉污染。

3、有效去除游离RNA背景

  从人或小鼠细胞中提取 RNA与另一物种的细胞混合，细胞被捕获至芯片后用缓冲液清洗去除游离 RNA 并进行后续操作，测序结果表明没有检测到来自其他物种的游离 RNA（图4 f，g），表明 Well-paired-seq 芯片具有优秀的游离 RNA 去除能力。此外，清洗可以轻松去除细胞悬液样品中的团聚细胞和碎片杂质，有利于进一步提高数据质量（图4 h，i）

图4 芯片性能测试数据

4、双胞率低且捕获无偏倚

  人细胞（K562 cells，Red）和小鼠细胞（NIH/3T3 cells，green）按 1：1数量比例混合上样到芯片中，最终分析得到 2,810 个人细胞和 2,254 个小鼠细胞（图5 a，b），测序结果展示的多胞率低于 3.5%（图5 c），并汇总达到不同捕获通量下的多胞率数据 （图5 h）。将小鼠细胞按1：300 的比例添加到人类细胞中，测序结果显示两物种细胞捕获比例与预期相符(1：350)（图5 i），表明Well-paired-seq 平台可实现对稀有单细胞的无偏倚检测。

图5 双细胞测试数据（人鼠混合细胞系）

  相关公众号推文中显示，人和小鼠的细胞系样本进行混样捕获，通过基因组的比对区分捕获细胞的物种来源，通过1:1比例混样测试结果显示多细胞捕获率在0.7%/1000 cells；（直接按4.20%/6=0.7%计算？？）

公众号推广数据

真实样本测试

  使用5 种人肺腺癌细胞系组成的混合样品测试Well-paired-seq 对复杂细胞种类组成的样本类型的解析能力，结果显示5 种细胞类型明显分为5个细胞群， 并且可以通过细胞特征基因的表达水平进行标记和区分（图6 a，b），并且两次重复实验中的各细胞占比与上样细胞比例保持一致（图6 c）。
  进一步用于外周血单个核细胞（PBMCs）的分析，对两名健康人的 PBMCs（合计8027 个细胞）进行单细胞转录组测序，聚类并注释后得到7个细胞群（图6 d），含 33.4%的 CD4+T细胞，15.8%的 CD8+T细胞，23.5%的 NK细胞，8.0% 的 B细胞，13.1% 的 CD14+单核细胞，4.3% 的 FCGR3A+单核细胞和 1.9%的树突状细胞。

图6 真实样本测试数据

多平台间对比

  以NIH/3T3 cells数据为例，该技术显示出优于其他技术平台的基因检测率（图7 e,f）。Well-Paired-Seq技术从NIH/3T3细胞中平均检测到39112个转录本和6085个基因。而scFTD-seq、seq-Well和Drop-seq分别检测到27 596、32 362和23 641个转录本以及5840、6712和5841个基因。

图7 多平台间数据对比

参考资料

  该技术文章，于2022年5月份发表在 Small Methods杂志（影响因子15.367） 。

技术原理-Small Methods封面文章